Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
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Pegue uma placa de vários poços contendo células semelhantes à microglia exibindo atividade fagocítica.
Incube com uma coloração nuclear para rotular os núcleos.
Adicione um inibidor de polimerização de actina ao poço de controle negativo.
Durante a incubação, o inibidor se liga aos filamentos de actina, inibindo a polimerização e fagocitose da actina.
Mantenha a placa em baixas temperaturas e adicione sinaptossomos humanos marcados com corante sensível ao pH - fragmentos isolados de terminais sinápticos neurais.
Centrifugue a placa a baixas temperaturas para promover as interações célula-sinaptossomo, mas evitar a absorção prematura.
Transfira a placa para um sistema de imagem de células vivas.
No poço de teste, os sinaptossomos são fagocitados e se fundem com os lisossomos formando fagolisossomos. O ambiente ácido lisossômico ativa o corante, resultando em sua fluorescência.
Com o tempo, no poço de teste, mais sinaptossomos são engolfados, causando um aumento adicional na fluorescência.
No entanto, no poço de controle negativo, a polimerização da actina é inibida, impedindo a captação de sinaptossomas. A fluorescência mínima resultante confirma a dependência da fluorescência na fagocitose mediada por actina.
No dia do ensaio, remova 40 microlitros de meio por poço e adicione 10 microlitros da solução de coloração nuclear. Incube a placa por duas horas. Descongele os sinaptossomos marcados no gelo e sonice suavemente usando um sonicador de água por um minuto. Novamente, coloque imediatamente os sinaptossomos no gelo. Dilua os sinaptossomos marcados e o meio completo IMG a 1 microlitro de sinaptossomos por 50 microlitros de meio.
Para controle negativo, prepare 60 citocalasina D micromolar em meio IMG completo para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Em seguida, adicione 10 microlitros desta solução a cada poço para uma concentração final de 10 micromolares e incube por 30 minutos. Retire a placa da incubadora e incube a 10 graus Celsius por 10 minutos. Mantenha o prato no gelo e adicione 50 microlitros de meio contendo sinaptossomos.
Centrifugue a placa a 270 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius e mantenha a placa no gelo até a aquisição da imagem. Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados. Em seguida, selecione uma lente objetiva de 20x. Em seguida, ajuste o tempo de integração do diodo emissor de luz ou da intensidade do LED de foco e o ganho do campo claro e dos canais azuis. A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial.
Selecione o número de blocos individuais a serem adquiridos em uma montagem por poço. Adquira 16 ladrilhos no centro do poço, gerando imagens de aproximadamente 5% da área total do poço. Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens.