JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:28 min • April 28th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo células semelhantes à microglia exibindo atividade fagocítica.
Incube com uma coloração nuclear para rotular os núcleos.
Adicione um inibidor de polimerização de actina ao poço de controle negativo.
Durante a incubação, o inibidor se liga aos filamentos de actina, inibindo a polimerização e fagocitose da actina.
Mantenha a placa em baixas temperaturas e adicione sinaptossomos humanos marcados com corante sensível ao pH - fragmentos isolados de terminais sinápticos neurais.
Centrifugue a placa a baixas temperaturas para promover as interações célula-sinaptossomo, mas evitar a absorção prematura.
Transfira a placa para um sistema de imagem de células vivas.
No poço de teste, os sinaptossomos são fagocitados e se fundem com os lisossomos formando fagolisossomos. O ambiente ácido lisossômico ativa o corante, resultando em sua fluorescência.
Com o tempo, no poço de teste, mais sinaptossomos são engolfados, causando um aumento adicional na fluorescência.
No entanto, no poço de controle negativo, a polimerização da actina é inibida, impedindo a captação de sinaptossomas. A fluorescência mínima resultante confirma a dependência da fluorescência na fagocitose mediada por actina.
No dia do ensaio, remova 40 microlitros de meio por poço e adicione 10 microlitros da solução de coloração nuclear. Incube a placa por duas horas. Descongele os sinaptossomos marcados no gelo e sonice suavemente usando um sonicador de água por um minuto. Novamente, coloque imediatamente os sinaptossomos no gelo. Dilua os sinaptossomos marcados e o meio completo IMG a 1 microlitro de sinaptossomos por 50 microlitros de meio.
Para controle negativo, prepare 60 citocalasina D micromolar em meio IMG completo para inibir a polimerização da actina e, portanto, a fagocitose. Em seguida, adicione 10 microlitros desta solução a cada poço para uma concentração final de 10 micromolares e incube por 30 minutos. Retire a placa da incubadora e incube a 10 graus Celsius por 10 minutos. Mantenha o prato no gelo e adicione 50 microlitros de meio contendo sinaptossomos.
Centrifugue a placa a 270 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius e mantenha a placa no gelo até a aquisição da imagem. Insira a placa em um leitor de imagens de células vivas e selecione os poços a serem analisados. Em seguida, selecione uma lente objetiva de 20x. Em seguida, ajuste o tempo de integração do diodo emissor de luz ou da intensidade do LED de foco e o ganho do campo claro e dos canais azuis. A fluorescência dos sinaptossomos deve ser insignificante no momento inicial.
Selecione o número de blocos individuais a serem adquiridos em uma montagem por poço. Adquira 16 ladrilhos no centro do poço, gerando imagens de aproximadamente 5% da área total do poço. Defina a temperatura para 37 graus Celsius e o intervalo de tempo desejado para a geração de imagens.
Este estudo investiga a atividade fagocítica de células semelhantes a micróglias utilizando um sistema de imagem em tempo real de células vivas. Os efeitos da inibição da polimerização de actina na captação de sinaptossomos são analisados para compreender os mecanismos da fagocitose.
Ensaios quantitativos de fagocitose em células vivas utilizando sinaptossomos humanos e células semelhantes a micróglias fornecem uma plataforma robusta para investigar mecanismos neuroimunes relevantes para linhas de doenças neurodegenerativas. Esta abordagem permite a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos ao isolar a função fagocítica dependente de actina em um sistema relevante para humanos. O ensaio oferece confiança preditiva para decisões precoces em portfólios de pesquisa em neuroinflamação e manutenção sináptica.
Este ensaio com células vivas situa-se dentro do continuum de descoberta inicial até a identificação de compostos líderes, fornecendo dados acionáveis para validação de alvos e estudos mecanicistas em neurobiologia.
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Última atualização: 29 agosto 2026