Detecção de Cotransportador 2 de Cloreto de Potássio Neuronal Fosforilado via Western Blotting

Pegue um lisado celular contendo cotransportador de cloreto de potássio 2, ou proteínas KCC2, que regulam os níveis de cloreto neuronal.

A fosforilação em locais reguladores interrompe a função do KCC2, modulando a atividade neuronal.

Adicione o lisado aos grânulos conjugados com anticorpos direcionados ao KCC2 fosforilado. Incube para permitir a ligação e, em seguida, lave para remover proteínas não ligadas e detritos celulares.

Trate com um tampão desnaturante em alta temperatura para liberar KCC2 e, em seguida, centrifugue para separar as contas.

Carregue o sobrenadante contendo KCC2 em um gel de eletroforese. Separe as proteínas em bandas para confirmar a presença de KCC2 fosforilado.

Transfira as bandas para uma membrana e, em seguida, incube em uma solução de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incubar com anticorpos primários direcionados ao KCC2 fosforilado.

Lave e incube com anticorpos secundários marcados com enzimas para rotular os anticorpos primários.

Lave novamente e adicione um substrato quimioluminescente, que reage com a enzima para produzir luz.

Meça a intensidade da luz para quantificar o KCC2 fosforilado no lisado.

Pipete 300 microlitros de proteína G sepharose em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, centrifugue a solução a 500 g durante dois minutos. Depois de descartar o sobrenadante, adicione 500 microlitros de PBS e vortex bem. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação e repetir este passo.

Em seguida, misture 1 miligrama de anticorpos anti-KCC2 treonina 906 e anti-KCC2 treonina 1007 com 200 microlitros de grânulos de proteína G sepharose, antes de completar o volume para 500 microlitros com PBS. Depois de agitar em uma plataforma vibratória ou girar a roda por duas horas a 4 graus Celsius, repita duas lavagens com PBS.

Realize a quantificação de proteínas nos lisados celulares e adicione 1 miligrama do lisado celular às esferas lavadas e incube em um rotador de ponta a ponta antes de girar. Faça três lavagens com PBS contendo cloreto de sódio 150 milimolares, seguidas de três lavagens com 200 microlitros de PBS antes de ressuspender o pellet final em 100 microlitros de tampão de amostra LDS.

Agite os tubos em um agitador de rotor em temperatura ambiente por cinco minutos. Incube-os em um bloco de aquecimento e centrifugue-os antes de usar o sobrenadante para carregamento de gel. Monte o aparelho de fundição western blot e despeje o gel separador 8% recém-preparado para fundir o gel, deixando cerca de 2 centímetros de espaço a partir do topo do vidro de fundição. Adicione 200 microlitros de isopropanol absoluto à configuração e deixe-a repousar em temperatura ambiente por 60 minutos.

Remova o isopropanol usando uma pipeta e enxágue cuidadosamente o gel com cerca de 200 microlitros de água destilada. Depois de adicionar gel de empilhamento a 6% recém-preparado à configuração de fundição, encaixe suavemente no pente e deixe repousar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, fixe o gel fundido no tanque de eletroforese.

Depois de despejar o tampão de corrida no tanque, carregue 5 microlitros de marcador de peso molecular no primeiro poço e uma quantidade igual de proteína em cada poço do gel SDS-PAGE. Encha os poços vazios com LDS e deixe o gel funcionar por cerca de 90 a 120 minutos a 120 volts. Reidrate a membrana de nitrocelulose com tampão de transferência contendo 20% de metanol.

Enxágue o gel e a membrana com o tampão de transferência e espalhe-os suavemente na pilha de preparação. Disponha o sanduíche a ser transferido nesta ordem, eletrodo negativo, espuma sanduíche, papel de filtro, gel SDS-PAGE enxaguado, membrana de nitrocelulose enxaguada, papel de filtro, espuma sanduíche, eletrodo positivo. Uma vez feito isso, empilhe o sanduíche montado no tanque de transferência e deixe funcionar a 90 volts por 90 minutos ou 30 volts por 360 minutos.

Bloqueie a membrana seca por 1 hora em temperatura ambiente usando um tampão de bloqueio. Incubar as membranas com diluições apropriadas de anticorpo primário e beta actina em tampão de bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius. Em seguida, dê três lavagens de TBST por 5 minutos cada.

Incube a membrana lavada com um anticorpo secundário diluído em um tampão de bloqueio por 60 minutos e repita três lavagens de TBST. Uma vez feito isso, coloque a membrana lavada na placa de imagem. Para desenvolver os sinais, espalhe a solução preparada misturando volumes iguais de cada reagente de quimioluminescência aprimorado na membrana, antes de transferir a placa de imagem para o sistema de imagem para imagem.