Detecção de Cotransportador 2 de Cloreto de Potássio Neuronal Fosforilado via Western Blotting

Pegue um lisado celular contendo cotransportador de cloreto de potássio 2, ou proteínas KCC2, que regulam os níveis de cloreto neuronal.

A fosforilação em locais reguladores interrompe a função do KCC2, modulando a atividade neuronal.

Adicione o lisado aos grânulos conjugados com anticorpos direcionados ao KCC2 fosforilado. Incube para permitir a ligação e, em seguida, lave para remover proteínas não ligadas e detritos celulares.

Trate com um tampão desnaturante em alta temperatura para liberar KCC2 e, em seguida, centrifugue para separar as contas.

Carregue o sobrenadante contendo KCC2 em um gel de eletroforese. Separe as proteínas em bandas para confirmar a presença de KCC2 fosforilado.

Transfira as bandas para uma membrana e, em seguida, incube em uma solução de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incubar com anticorpos primários direcionados ao KCC2 fosforilado.

Lave e incube com anticorpos secundários marcados com enzimas para rotular os anticorpos primários.

Lave novamente e adicione um substrato quimioluminescente, que reage com a enzima para produzir luz.

Meça a intensidade da luz para quantificar o KCC2 fosforilado no lisado.

Pipete 300 microlitros de proteín