Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
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Pegue uma retina quimicamente fixada isolada do olho de um rato.
O olho exibe danos induzidos pelo calor no plexo vascular límbico, uma rede de vasos sanguíneos ao redor da córnea.
Este dano bloqueia a drenagem de fluidos, aumentando a pressão intraocular (PIO) e causando degeneração das células ganglionares da retina (RGC).
Trate a retina com uma solução de permeabilização para permeabilizar as membranas celular e nuclear.
Aplique uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Remova a solução de bloqueio.
Introduza anticorpos primários que têm como alvo um fator de transcrição predominantemente expresso em RGCs.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Contra-core os núcleos com um corante de ligação ao DNA.
Lave a retina e monte-a em uma lâmina de vidro usando um meio de montagem apropriado.
Visualize a retina sob um microscópio de epifluorescência.
Uma densidade celular reduzida no olho danificado em comparação com o controle confirma a degeneração do RGC devido ao aumento da PIO.
Depois de isolar as retinas, transfira-as para uma placa de cultura de 24 poços contendo 1 mililitro de PBS, mantendo a retina interna voltada para cima. Permeabilize o tecido lavando com um surfactante não iônico a 0,5% diluído em PBS. Em seguida, incube o tecido em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Durante a incubação, prepare a solução de anticorpo primário BRM 3A e armazene a 4 graus Celsius.
Após o bloqueio do tecido, incube as retinas em 200 microlitros de solução de anticorpo primário a 4 graus Celsius por 72 horas com agitação suave. Em seguida, lave o lenço com PBS. Incubar o tecido em 200 microlitros da solução de anticorpo secundário por duas horas em temperatura ambiente e, em seguida, com solução de contracoloração nuclear por 10 minutos para coloração de núcleos fluorescentes.
Após três lavagens de PBS, transfira a retina para uma lâmina de microscópio de vidro usando dois pincéis pequenos, mantendo o lado vítreo para cima. Posicione o quadrante dorsal da retina para cima na lâmina do microscópio. Por fim, aplique 200 microlitros de meio de montagem antidesbotamento em uma lamínula de vidro e coloque-a na retina plana para análise microscópica. Sob um microscópio confocal de epifluorescência usando uma objetiva de ampliação de 40 vezes, examine as montagens planas para estimar as células ganglionares da retina.