Avaliação dos níveis de neurotransmissores excitatórios em ratos induzidos por epilepsia crônica

Pegue um rato controle e um rato induzido por epilepsia crônica implantado com uma cânula guia e um eletrodo de eletroencefalograma, ou EEG, no hipocampo.

A indução da epilepsia aumenta a liberação de neurotransmissores excitatórios, causando influxo de íons nas células pós-sinápticas, o que gera potenciais excitatórios contínuos. Isso leva a rajadas sincronizadas de atividade elétrica, denominadas convulsões, registradas usando o eletrodo.

Insira uma sonda de microdiálise com uma membrana semipermeável na cânula.

Amarre o rato à gaiola de um sistema de registro de EEG.

Infunda um tampão fisiológico no tecido cerebral através da entrada da sonda.

Garanta a ausência de convulsão e colete fluido extracelular através da saída da sonda para avaliar os níveis de neurotransmissores.

Um nível basal elevado no rato epiléptico indica um aumento mediado por epilepsia.

Infunda um tampão de potássio alto e colete amostras.

O aumento do potássio prolonga a excitabilidade neuronal, desencadeando a liberação contínua de neurotransmissores.

Um aumento temporário nos níveis de neurotransmissores nos ratos epilépticos e controle indica um alto aumento induzido pelo potássio.

Comece preparando as sondas de microdiálise para o primeiro uso de acordo com o guia do usuário do fabricante e preencha-as com solução de ringer. Em seguida, corte pedaços de tubo FEP de 10 centímetros de comprimento e conecte-os às cânulas de entrada e saída da sonda, usando os adaptadores de tubo de cores diferentes. Certifique-se de que a tubulação toque nos adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.

Remova a cânula fictícia de sua guia usando a pinça, segurando a cabeça do animal com firmeza. Insira a sonda de microdiálise na cânula guia e use massa de modelar para firmar ainda mais a cânula. Em seguida, conecte o animal ao sistema de registro de EEG amarrado. Em seguida, coloque o animal no cilindro de acrílico e deixe-o explorar o novo ambiente. Siga os movimentos dos ratos acordados e em movimento livre.

Em seguida, conecte a entrada da sonda à seringa de 2.5 mililitros com uma agulha embotada de calibre 22 contendo a solução de Ringer usando os adaptadores de tubo. Empurre um mililitro de solução de ringer para dentro da sonda em 10 segundos, empurrando o pistão da seringa de 2,5 mililitros continuamente. Verifique se a gota do líquido que aparece na saída indica quando a sonda está pronta para uso. Por fim, encha as seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP por adaptadores de tubulação com solução de ringer e monte-as na bomba de infusão. Ligue a bomba a dois microlitros por minuto e deixe-a funcionar durante a noite.

Após verificar, por meio de gravações de vídeo EEG, a ausência de convulsões nas três horas anteriores à coleta da amostra, pare a bomba que transporta as seringas canuladas do tubo FEP preenchidas com solução de ringer. Monte outro conjunto de seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP com adaptadores de tubulação preenchidos com uma solução de ringer modificada contendo solução de potássio 100 milimolar. Ligue a bomba a 2 microlitros por minuto e deixe-a funcionar. Verifique a ausência de bolhas de ar no sistema e certifique-se de que a tubulação toque nos adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.

Em seguida, verifique se a gota do líquido que aparece na saída indica quando a sonda está pronta para uso. Em seguida, conecte o tubo FEP de seringas cheias de solução de ringer à cânula de entrada da sonda em cada animal e aguarde o aparecimento da gota de líquido na ponta da saída. Conecte a saída da sonda à tubulação FEP, o que leva à coleta no tubo de ensaio.

Insira a tubulação FEP no tubo de ensaio fechado de 0.2 mililitros com uma tampa perfurada. E certifique-se de que o tubo permaneça no lugar fixando-o com um pedaço de massa de modelar. Depois de operar a bomba a 2 microlitros por minuto por 60 minutos sem coletar amostras para equilibrar, o sistema coleta cinco amostras consecutivas de dialisado de 30 minutos em condições basais. E armazene amostras no gelo.

Após 10 minutos, troque o tubo das seringas contendo solução de ringer de potássio 100 milimolares para solução de ringer normal e deixe a bomba funcionar. Após a colheita do quinto dialisado pós-equilíbrio, recolher 20 fracções de dialisato de microlitros de 10 em 10 minutos durante uma hora. Em seguida, colete três amostras adicionais de dialisado de 30 minutos e pare a bomba. Por fim, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius após o experimento até a análise por HPLC.