Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:19 min. • April 28th, 2025
Pegue uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo em um tampão.
O espécime é revestido com platina para realçar os detalhes da superfície e com carbono para estabilidade estrutural.
Transfira a amostra para um frasco com um tampão de digestão contendo detergente.
Incube para facilitar a quebra do tecido, deixando intacta a membrana e as proteínas embutidas no revestimento.
Lave com tampão para remover detritos.
Adicione uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Introduza anticorpos primários específicos para a proteína alvo da membrana neuronal.
Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.
Incube com anticorpos secundários conjugados com ouro que se ligam a anticorpos primários.
Lave com tampão para remover o excesso de anticorpos.
Enxágue com água para evitar artefatos de resíduos de sal durante a microscopia.
Monte a amostra em um microscópio eletrônico de transmissão ou grade TEM.
Sob o TEM, visualize a proteína alvo da membrana neuronal identificada por partículas douradas, que aparecem como pontos pretos.
Para a digestão SDS, transfira uma réplica para um frasco de vidro de 4 mililitros cheio de 1 mililitro de tampão de digestão SDS. Deixe digerir por 18 horas a 80 graus Celsius com agitação. Para imunomarcação, lave a réplica por 10 minutos em tampão de digestão SDS fresco. Em seguida, incube-o com anticorpos primários e secundários diluídos em 2% de BSA TBS em uma câmara úmida a 15 graus Celsius por 24 a 72 horas.
Depois disso, monte a réplica em uma grade de barra paralela de 100 linhas revestida com formvar. Imagem da réplica com um microscópio eletrônico de transmissão a 80 ou 100 quilovolts. Em seguida, adquira as imagens digitais através de uma câmera CCD.