JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:34 min • April 28th, 2025
Pegue uma lâmina com câmara com uma cultura de monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro de rato, ou RBMECs.
As células são conectadas por proteínas de junção apertada ligadas ao citoesqueleto de actina, imitando a camada endotelial da barreira hematoencefálica.
Substitua o meio por um meio desoxigenado sem glicose e, em seguida, coloque a lâmina em uma câmara de hipóxia.
A indisponibilidade de oxigênio e glicose inibe a síntese de ATP. O ATP restante é dividido em derivados de nucleotídeos.
A depleção de ATP dificulta as bombas de cálcio, elevando o cálcio intracelular que ativa as enzimas oxidorredutase.
Em seguida, reabasteça com um meio oxigenado e coloque a lâmina em uma incubadora oxigenada. As oxidorredutases ativadas utilizam o oxigênio reintroduzido para degradar os derivados de nucleotídeos, gerando espécies reativas de oxigênio ou ROS.
ROS interrompe as interações entre proteínas de junção apertada e induz vias de sinalização que remodelam o citoesqueleto de actina em fibras de estresse, enfraquecendo as interações célula-célula.
A monocamada com interações intercelulares interrompidas está pronta para análise.
Na preparação, configure e calibre o sistema de cultura de células de hipóxia de acordo com as instruções do fabricante. O ambiente da câmara deve ser 95% de nitrogênio, 5% de dióxido de carbono e a 37 graus Celsius. Agora, desoxigene o dmem livre de glicose colocando-o na câmara de hipóxia por 4 a 6 horas. Mais tarde, comece a estressar as células substituindo seu meio pelo DMEM desoxigenado sem glicose. E então colocar as células na câmara de hipóxia por duas horas. Após duas horas, coloque as células de volta no meio completo de células endoteliais do cérebro de rato. Em seguida, reoxigene as células, devolvendo-as às condições normais por uma hora.