Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:06 min. • April 28th, 2025
Pegue uma seção de cérebro de camundongo quimicamente fixada.
Adicione uma mistura de hibridização contendo um agente de permeabilização e sondas de RNA marcadas com FITC ou DIG.
Incubar para permitir a permeabilização celular e a entrada da sonda.
As sondas se ligam a sequências complementares no mRNA MBP, um marcador de referência expresso de forma ubíqua em oligodendrócitos, ou mRNA ASPA, o alvo.
Lave para remover as sondas não ligadas.
Adicione um tampão de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Introduzir anticorpos anti-FITC conjugados com HRP direcionados à sonda marcada com FITC.
Lave e adicione FITC-tiramida.
O HRP oxida a tiramida FITC em uma forma altamente reativa que se liga a proteínas próximas, amplificando o sinal de fluorescência.
Lave e reintroduza o tampão de bloqueio.
Adicione anticorpos anti-DIG conjugados com fosfatase alcalina direcionados à sonda marcada com DIG.
Lave e aplique a solução Fast Red.
A fosfatase alcalina desfosforila Fast Red, produzindo um precipitado fluorescente.
Visualize sob um microscópio de fluorescência.
A co-localização dos sinais Mbp e ASPA indica a expressão de ASPA em oligodendrócitos.
Dilua as duas sondas em tampão de hibr
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