Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

Pegue fatias de cérebro de camundongo fixas e permeabilizadas contendo neurônios, incluindo neurônios colinérgicos que expressam colina acetiltransferase.

As fatias são submetidas a hibridização fluorescente in situ para detectar mRNAs alvo localizados em axônios colinérgicos, resultando em sinais amplificados usando sondas fluorescentes, que são detectadas com microscopia de fluorescência.

Adicione uma solução de bloqueio contendo proteínas e um agente de têmpera. As proteínas impedem a ligação inespecífica e o agente de têmpera neutraliza os fixadores residuais.

Incubar com anticorpos primários que têm como alvo a colina acetiltransferase neuronal

.

Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários ligados à colina acetiltransferase.

Lave com tampão para remover o excesso de anticorpos e, em seguida, enxágue em água destilada para remover os resíduos do tampão.

Monte as fatias com mídia de montagem contendo uma coloração nuclear para rotular os núcleos.

Usando microscopia de fluorescência, imagine as fatias para visualizar os sinais de mRNA alvo e os axônios colinérgicos corados com anticorpos específicos.

Cubra cada fatia com 100 a 200 microlitros de solução de bloqueio, contendo três miligramas por mililitro de BSA, 100 milimolares de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS. Cubra cada lâmina com parafilme e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, a 100 a 200 microlitros de anticorpo diluído em solução de bloqueio para as lâminas, um anticorpo anticolina acetiltransferase é usado aqui. Após a cobertura, as lâminas com parafilme, incubam por dois dias a quatro graus Celsius. Certifique-se de que as fatias do cérebro não sequem. Se necessário, reaplique a solução de anticorpo anti-chAT em fatias cerebrais 24 horas após a incubação.

Depois de lavar as lâminas três vezes em 1X PBS por cinco minutos em temperatura ambiente, adicione 100 a 200 microlitros do anticorpo secundário conjugado Alexa apropriado às lâminas. Cubra com parafilme e incube por uma hora em temperatura ambiente, protegido da luz.

Após a hora, lave as lâminas três vezes em 1X PBS por cinco minutos cada como antes e, em seguida, lave uma vez com água destilada. Monte as lâminas com um suporte de montagem que contenha DAPI. E então visualize as fatias do cérebro sob o microscópio de fluorescência.