Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

Pegue fatias de cérebro de camundongo fixas e permeabilizadas contendo neurônios, incluindo neurônios colinérgicos que expressam colina acetiltransferase.

As fatias são submetidas a hibridização fluorescente in situ para detectar mRNAs alvo localizados em axônios colinérgicos, resultando em sinais amplificados usando sondas fluorescentes, que são detectadas com microscopia de fluorescência.

Adicione uma solução de bloqueio contendo proteínas e um agente de têmpera. As proteínas impedem a ligação inespecífica e o agente de têmpera neutraliza os fixadores residuais.

Incubar com anticorpos primários que têm como alvo a colina acetiltransferase neuronal

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Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários ligados à colina acetiltransferase.

Lave com tampão para remover o excesso de anticorpos e, em seguida, enxágue em água destilada para remover os resíduos do tampão.

Monte as fatias com mídia de montagem contendo uma coloração nuclear para rotular os núcleos.

Usando microscopia de fluorescência, imagine as fatias para visualizar os sinais de mRNA alvo e os axônios colinérgicos corados com antic