Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3
17 de agosto de 2011
Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a aplicação da Flex Station três para estudar o perfil farmacológico do potencial receptor transitório ou disparar um canal. Isso é feito primeiro preparando células que expressam uma viagem de um canal em 96. Placas de microtitulação de poços.
Depois de lavar as células em uma lavadora de microplacas, as células são carregadas com o corante fluorescente sensível ao cálcio. Gripe oh 4:00 da manhã, um período de carregamento celular é seguido por várias lavagens adicionais. O próximo passo do procedimento é preparar a placa composta, incluindo um disparo, um agonista e um disparo putativo, um antagonista.
Como etapa final, os parâmetros do software são configurados para leitura de placas no sistema Flex Station três. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram relações de resposta à dose para a ativação do trip A um pelo ácido fonêmico da gripe e inibição pelo composto antagonista A Embora este método possa fornecer informações sobre 21 mecanismos de ativação medindo o influxo de cálcio. Também pode ser aplicado para estudar funções de outros canais oculares permeáveis ao cálcio e receptores acoplados a proteínas profundas usando corantes congelados sensíveis ao cálcio ou corantes com potencial matemático.
A principal vantagem dessa tática sobre os métodos existentes, como imagens de cálcio e mapeamento manual de patches, é que essa técnica de economia de tempo fornece triagem de alto rendimento para a função e modulação da fórmula de cálcio, canais de ferro e outros receptores de mobilização de ca. Antes do início deste protocolo, cultive HEC 2 93 células transfectadas de forma estável com trip A one a uma densidade de 70 a 90%, conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar a preparação celular para o ensaio de cálcio, revestir placas de 96 poços pipetando 50 microlitros de poli L ornitina em cada poço, incube as placas a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos.
Após a incubação, enxágue as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato da KO Após a tripsina, as células HEC 2 93 transferem a quantidade desejada de células para um tubo inferior cônico estéril de 15 mililitros e centrífuga. A amostra. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular resultante.
No meio de cultura DMEM suplementado com soro fetal bovino inativado por 10% de calor, dispensar 100 microlitros da suspensão celular para cada poço da placa de 96 poços. Usando um pipetador multicanal, deixe a placa descansar no exaustor por pelo menos 30 minutos antes de colocá-la na incubadora de cultura de células umidificada por 20 a 44 horas. Para a preparação do ensaio de cálcio, primeiro prepare as soluções conforme descrito no protocolo escrito.
Depois de preparado, misturou 10 microlitros de um milimolar de gripe oh 4:00 da manhã com 10 microlitros de onic. F1 27, transfira todo o conteúdo para cinco mililitros de gripe. Oh quatro tampão de ensaio suplementado com 0,1% de albumina de soro bovino.
Em seguida, lave as células cultivadas em 96. Placas de poço com HBSS a 80 microlitros por poço duas vezes usando uma lavadora de microplacas após a lavagem, adicione a solução de carregamento flu oh 4:00 AM a 50 microlitros por poço com um pipetador multicanal e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Durante o período de carga celular de uma hora, prepare uma série de três soluções x de agonistas, uma série de três x soluções de antagonista e um grande volume de agonista 300 micromolar na pipeta tampão de ensaio flu oh four.
300 microlitros das soluções compostas diluídas em uma placa composta de 96 poços. Providencie para que a diluição em série de um composto e os controlos positivos e negativos correspondentes sejam colocados na mesma coluna da placa composta, sempre que possível. À medida que a estação Flex três lê uma única coluna de cada vez, em seguida, pipeta 300 microlitros da solução agonista micromolar 300 adjacente a cada poço contendo o antagonista como etapa final de preparação celular.
Lave as células carregadas três vezes com o tampão ácido de gripe ou quatro usando a lavadora de microplacas após a última lavagem. Deixe 80 microlitros de tampão ácido de gripe ou quatro em cada poço. Para iniciar a leitura da placa, ligue o sistema Flex Station três e abra o software soft max Pro 5.2.
Salve o experimento com um novo nome de arquivo na configuração. Escolha o modo flexível e insira os parâmetros para medir o efeito agonista e antagonista, conforme listado no procedimento escrito. Em seguida, coloque uma nova caixa de pontas, a placa composta e a placa de leitura nas bandejas apropriadas da estação flexível. Três.
Comece a leitura da placa clicando no botão de leitura no software Soft Max Pro. O Flex Station três lerá uma coluna de cada vez e adicionará compostos nos pontos de tempo pré-programados sem interromper a leitura. Uma vez concluída a execução, os dados experimentais podem ser processados diretamente usando o software Soft Max PRO ou copiados e colados em qualquer programa de planilha, como o Microsoft Excel.
Para analisar os dados, gere curvas de resposta de concentração para a viagem, um ácido fonêmico da gripe com um agonista e, para a viagem putativa, um composto antagonista usando o ajuste de mínimos quadrados, conforme descrito na viagem de procedimento escrito. Um é uma ativação do canal catiônico permeável ao cálcio que leva ao influxo de cálcio que pode ser detectado pelo corante sensível ao cálcio da gripe oh 4:00 da manhã. Traços representativos dos cursos de tempo para mudanças de fluorescência em resposta a uma série de concentrações de ácido fonêmico ou FFA da gripe são mostrados em concentrações mais altas. A fluorescência evocada por FFA aumenta com uma cinética muito mais rápida do que em concentrações mais baixas, apesar dos níveis de fluorescência de pico semelhantes.
Para distinguir essas diferenças, a relação concentração-resposta foi construída medindo as taxas iniciais de aumento de fluorescência. Após a adição de concentrações variadas de AGL, a metade da concentração efetiva máxima de AGL foi determinada em 55,4 micromolar. A relação concentração-resposta de inibição da resposta de cálcio evocada por FFA por uma viagem putativa a um composto antagonista A também é mostrada composto.
Uma dose reduziu independentemente a resposta das células trip A one ao FFA com uma concentração inibitória máxima de 4,3 micromolar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar os perfis farmacológicos do triplo A um e canais relacionados usando a estação de bandeira três.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um protocolo para estudar o perfil farmacológico de canais TRPA1 humanos utilizando o FlexStation 3. O procedimento inclui a preparação das células, carregamento com corante e operação do leitor de microplacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Os canais TRPA1 são importantes na transdução sensorial.
- Compreender seu perfil farmacológico pode auxiliar no desenvolvimento de medicamentos.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta versátil para triagem em alto rendimento.
- Corantes sensíveis ao cálcio são utilizados para medir a atividade do canal.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o estudo dos canais TRPA1.
- Demonstrar o uso do FlexStation 3 em estudos farmacológicos.
- Facilitar a compreensão da modulação dos canais TRPA1.
Métodos Utilizados
- Preparação de células expressando canais TRPA1 em placas de microtitulação.
- Lavagem das células utilizando um lavador de microplacas.
- Carregamento das células com corante fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4 AM).
- Preparação de placas de compostos com agonistas e antagonistas de TRPA1.
Resultados Principais
- Carregamento bem-sucedido das células com o corante fluorescente.
- Uso eficaz do FlexStation 3 para medir a atividade de TRPA1.
- Identificação de moduladores de TRPA1 por meio de perfil farmacológico.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo na pesquisa.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar os canais TRPA1.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta eficaz para estudos farmacológicos.
- Compreender a modulação do TRPA1 pode levar a avanços terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o perfilamento farmacológico de canais TRP com produtividade média a alta por meio de medidas de fluxo de cálcio, auxiliando na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Ao quantificar a potência de agonistas e a inibição por antagonistas em um formato automatizado e reprodutível, fornece confiança preditiva para priorizar moduladores de canais iônicos em etapas de descoberta. A abordagem reduz a dependência de eletrofisiologia de baixa produtividade, acelerando a evolução de compostos ativos para candidatos pré-clínicos em alvos sensoriais e fisiopatológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa a função do canal TRPA1 por meio da entrada de cálcio dependente da dose, permitindo a confirmação mecanicista do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Utiliza células HEK293 que expressam o TRPA1 humano para estabelecer um modelo de superexpressão transponível para investigação farmacológica.
- Valor Preditivo: Gera valores de CE50 e CI50 (55,4 µM e 4,3 µM, respectivamente) para apoiar a relação estrutura-atividade no início da identificação de compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece leituras quantitativas e em tempo real de fluorescência por meio do Fluo-4 AM, permitindo a avaliação do fator Z' e a análise da robustez do ensaio.
- Compatibilidade com Alto Rendimento: Aproveita a leitura coluna por coluna do FlexStation 3 com transferência automatizada de fluidos para triagem no formato de 96 poços.
- Compatibilidade de Reagentes: Demonstra o uso de corantes sensíveis ao cálcio e de pipetagem multicanal para carregamento consistente do corante e entrega de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para doenças: O papel do TRPA1 na nocicepção sustenta seu uso como um indicador mecanicista para a modulação de vias da dor em triagens pré-clínicas de segurança e eficácia.
- Continuidade translacional: Permite consistência entre diferentes formatos, desde modelos de superexpressão até a validação em tecidos nativos, utilizando o mesmo princípio de leitura de fluxo.
- Utilidade na redução de riscos: Reduz resultados falso-positivos ao confirmar o fluxo de cálcio como leitura funcional antes de investir em modelos de patch-clamp ou in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no fluxo de trabalho de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, fornecendo uma etapa intermediária escalonável entre a confirmação de superexpressão e a validação eletrofisiológica secundária.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a modulação de canais TRP ao isolar o fluxo de cálcio como uma saída funcional direta da ativação do canal.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da adição automatizada de reagentes e leitura cinética no modo Flex.
- Análises: Gera curvas concentração-resposta baseadas na taxa inicial, permitindo a discriminação cinética da eficácia do agonista além da amplitude máxima.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao estabelecer uma leitura conservada (fluxo de cálcio) aplicável em diversos sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de outros canais permeáveis a Ca2+ (por exemplo, TRPV1, TRPM8) e receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando a mesma configuração de corante e leitor.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece desvio de risco mecanicista ao confirmar a modulação do alvo por meio de um segundo mensageiro direto e quantificável (Ca2+).
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de leitura automatizada de placas e análise cinética.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos ao gerar perfis farmacológicos precoces com limiares de potência definidos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de moduladores de canais iônicos com base na potência funcional e seletividade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, transfeção transitória/estável e manipulação de corantes fluorescentes.
- Depende do FlexStation 3 com modo FLEX, SoftMax Pro e um lavador de microplacas para manipulação automatizada de fluidos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de carregamento de corantes e do formato das placas de compostos para resultados consistentes.
- A adaptação a células nativas ou primárias pode exigir otimização dos níveis de expressão e da fluorescência de fundo.
- Limitado a leituras fluorescentes; incompatível com corantes suscetíveis à quenchagem ou compostos que interferem na excitação/emissão do Fluo-4 AM.
