Baseados em células de Ensaio de cálcio para Médio a High Throughput Screening de Funções TRP usando FlexStation Canal 3
17 de agosto de 2011
Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a aplicação do Flex Station três para estudar o perfil farmacológico do canal do tipo receptor potencial transitório, ou trip a um. Isso é realizado primeiramente preparando células que expressam canais trip a um em placas de microtitulação de 96 poços.
Após lavar as células em um lavador de microplacas, as células são carregadas com o corante fluorescente sensível ao cálcio. Flu oh 4:00 AM um período de carregamento celular é seguido então por várias lavagens adicionais. O próximo passo do procedimento é preparar a placa de compostos, incluindo um agonista trip a um e um antagonista trip a um putativo.
Como etapa final, os parâmetros do software são configurados para a leitura da placa no sistema Flex Station três. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram relações de resposta dose-dependente para a ativação do trip A um pelo ácido flu fonêmico e inibição pelo composto antagonista A. Embora este método possa fornecer informações sobre mecanismos de ativação do 21 mediante a medição da entrada de cálcio, ele também pode ser aplicado para estudar funções de outros canais iônicos permeáveis ao cálcio e receptores acoplados à proteína G, utilizando corantes congelados sensíveis ao cálcio ou corantes de potencial de mali.
A principal vantagem desta Tática em relação a métodos existentes, como a imagem de cálcio e o mapeamento manual por patch, é que esta técnica econômica em tempo permite triagem de alto rendimento para a função e modulação de fórmulas de cálcio, canais de ferro e outros receptores mobilizadores de Ca. Antes do início deste protocolo, cultive células HEC 293 estavelmente transfectadas com trip A um até uma densidade de 70 a 90%, conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar o preparo das células para o ensaio de cálcio, revista placas de 96 poços pipetando 50 microlitros de poli-L-ornitina em cada poço e incube as placas a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos.
Após a incubação, lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato de KO. Após a tripsina, transfira a quantidade desejada de células HEC 293 para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue a amostra. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular resultante.
No meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, distribua 100 microlitros da suspensão celular em cada poço da placa de 96 poços. Utilizando uma pipeta multicanal, deixe a placa repousar na câmara de fluxo laminar por pelo menos 30 minutos antes de colocá-la no incubador de cultura celular umidificado por 20 a 44 horas. Para o preparo do ensaio de cálcio, prepare primeiro as soluções conforme descrito no protocolo escrito.
Uma vez preparado, misture 10 microlitros de flu oh 4:00 AM a um milimolar com 10 microlitros de ônix. F1 27, transfira todo o conteúdo para cinco mililitros de tampão do ensaio flu. Oh quatro suplementado com 0,1% de albumina sérica bovina.
Em seguida, lave as células cultivadas em placas de 96 poços com HBSS a 80 microlitros por poço duas vezes, utilizando um lavador de microplacas. Após a lavagem, adicione a solução de marcação com fluo-4 AM a 50 microlitros por poço com uma pipeta multicanal e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Durante o período de marcação celular de uma hora, prepare uma série de soluções três vezes concentradas de agonistas, uma série de soluções três vezes concentradas de antagonistas e um grande volume de agonista 300 micromolar no tampão de ensaio com fluo-4.
300 microlitros das soluções do composto diluído em uma placa de compostos de 96 poços. Organize de forma que a diluição seriada de um composto e os respectivos controles positivo e negativo estejam na mesma coluna da placa de compostos sempre que possível. Como o Flex Station três lê uma única coluna por vez, pipete 300 microlitros da solução do agonista a 300 micromolares adjacentes a cada poço contendo o antagonista como etapa final de preparação celular.
Lave as células carregadas três vezes com o tampão de ácido fluoretídrico 04 usando o lavador de microplacas após a última lavagem. Deixe 80 microlitros do tampão de ácido fluoretídrico 04 em cada poço. Para iniciar a leitura da placa, ligue o sistema Flex Station 3 e abra o software Soft Max Pro 5.2.
Salve o experimento com um novo nome de arquivo na configuração. Escolha o modo flex e insira os parâmetros para medir o efeito do agonista e do antagonista conforme listado no procedimento escrito. Em seguida, coloque uma nova caixa de ponteiras, a placa de compostos e a placa de leitura nas bandejas apropriadas da estação flex.Three.
Inicie a leitura da placa clicando no botão de leitura no software Soft Max Pro. O Flex Station três lerá uma coluna por vez e adicionará compostos nos pontos de tempo previamente programados sem interromper a leitura. Após a conclusão do experimento, os dados podem ser processados diretamente usando o software Soft Max PRO ou copiados e colados em qualquer programa de planilha, como o Microsoft Excel.
Para analisar os dados, gere curvas de resposta à concentração para o trip, um agonista ácido flu fonêmico e para o composto putativo antagonista do trip a um utilizando ajuste pelos mínimos quadrados conforme descrito no procedimento escrito trip. O trip a um é um canal catiônico permeável ao cálcio cuja ativação leva à entrada de cálcio, que pode ser detectada pelo corante sensível ao cálcio flu oh 4:00 AM. Traços representativos dos cursos temporais das alterações de fluorescência em resposta a uma série de concentrações de ácido flu fonêmico ou FFA são mostrados em concentrações mais elevadas. A FFA provocou aumento da fluorescência com cinética muito mais rápida do que em concentrações mais baixas, apesar de níveis de pico de fluorescência semelhantes.
Para distinguir essas diferenças, a relação concentração-resposta foi construída mediante a medição das taxas iniciais de aumento da fluorescência. Após a adição de concentrações variadas de FFA, a concentração efetiva máxima metade de FFA foi determinada como sendo 55,4 micromolar. Também é mostrada a relação concentração-resposta de inibição da resposta de cálcio induzida por FFA por um composto antagonista putativo do trip a um, o composto A.
Uma dose reduziu independentemente a resposta das células triplo A um ao FFA com uma concentração inibitória máxima de 4,3 micromolar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar os perfis farmacológicos dos canais triplo A um e relacionados utilizando a estação flag três.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um protocolo para estudar o perfil farmacológico de canais TRPA1 humanos utilizando o FlexStation 3. O procedimento inclui a preparação das células, carregamento com corante e operação do leitor de microplacas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Os canais TRPA1 são importantes na transdução sensorial.
- Compreender seu perfil farmacológico pode auxiliar no desenvolvimento de medicamentos.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta versátil para triagem em alto rendimento.
- Corantes sensíveis ao cálcio são utilizados para medir a atividade do canal.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o estudo dos canais TRPA1.
- Demonstrar o uso do FlexStation 3 em estudos farmacológicos.
- Facilitar a compreensão da modulação dos canais TRPA1.
Métodos Utilizados
- Preparação de células expressando canais TRPA1 em placas de microtitulação.
- Lavagem das células utilizando um lavador de microplacas.
- Carregamento das células com corante fluorescente sensível ao cálcio (Fluo-4 AM).
- Preparação de placas de compostos com agonistas e antagonistas de TRPA1.
Resultados Principais
- Carregamento bem-sucedido das células com o corante fluorescente.
- Uso eficaz do FlexStation 3 para medir a atividade de TRPA1.
- Identificação de moduladores de TRPA1 por meio de perfil farmacológico.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo na pesquisa.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar os canais TRPA1.
- O FlexStation 3 é uma ferramenta eficaz para estudos farmacológicos.
- Compreender a modulação do TRPA1 pode levar a avanços terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o perfilamento farmacológico de canais TRP com produtividade média a alta por meio de medidas de fluxo de cálcio, auxiliando na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Ao quantificar a potência de agonistas e a inibição por antagonistas em um formato automatizado e reprodutível, fornece confiança preditiva para priorizar moduladores de canais iônicos em etapas de descoberta. A abordagem reduz a dependência de eletrofisiologia de baixa produtividade, acelerando a evolução de compostos ativos para candidatos pré-clínicos em alvos sensoriais e fisiopatológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa a função do canal TRPA1 por meio da entrada de cálcio dependente da dose, permitindo a confirmação mecanicista do engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Utiliza células HEK293 que expressam o TRPA1 humano para estabelecer um modelo de superexpressão transponível para investigação farmacológica.
- Valor Preditivo: Gera valores de CE50 e CI50 (55,4 µM e 4,3 µM, respectivamente) para apoiar a relação estrutura-atividade no início da identificação de compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece leituras quantitativas e em tempo real de fluorescência por meio do Fluo-4 AM, permitindo a avaliação do fator Z' e a análise da robustez do ensaio.
- Compatibilidade com Alto Rendimento: Aproveita a leitura coluna por coluna do FlexStation 3 com transferência automatizada de fluidos para triagem no formato de 96 poços.
- Compatibilidade de Reagentes: Demonstra o uso de corantes sensíveis ao cálcio e de pipetagem multicanal para carregamento consistente do corante e entrega de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para doenças: O papel do TRPA1 na nocicepção sustenta seu uso como um indicador mecanicista para a modulação de vias da dor em triagens pré-clínicas de segurança e eficácia.
- Continuidade translacional: Permite consistência entre diferentes formatos, desde modelos de superexpressão até a validação em tecidos nativos, utilizando o mesmo princípio de leitura de fluxo.
- Utilidade na redução de riscos: Reduz resultados falso-positivos ao confirmar o fluxo de cálcio como leitura funcional antes de investir em modelos de patch-clamp ou in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no fluxo de trabalho de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, fornecendo uma etapa intermediária escalonável entre a confirmação de superexpressão e a validação eletrofisiológica secundária.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a modulação de canais TRP ao isolar o fluxo de cálcio como uma saída funcional direta da ativação do canal.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da adição automatizada de reagentes e leitura cinética no modo Flex.
- Análises: Gera curvas concentração-resposta baseadas na taxa inicial, permitindo a discriminação cinética da eficácia do agonista além da amplitude máxima.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao estabelecer uma leitura conservada (fluxo de cálcio) aplicável em diversos sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de outros canais permeáveis a Ca2+ (por exemplo, TRPV1, TRPM8) e receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando a mesma configuração de corante e leitor.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece desvio de risco mecanicista ao confirmar a modulação do alvo por meio de um segundo mensageiro direto e quantificável (Ca2+).
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de leitura automatizada de placas e análise cinética.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos ao gerar perfis farmacológicos precoces com limiares de potência definidos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de moduladores de canais iônicos com base na potência funcional e seletividade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, transfeção transitória/estável e manipulação de corantes fluorescentes.
- Depende do FlexStation 3 com modo FLEX, SoftMax Pro e um lavador de microplacas para manipulação automatizada de fluidos.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de carregamento de corantes e do formato das placas de compostos para resultados consistentes.
- A adaptação a células nativas ou primárias pode exigir otimização dos níveis de expressão e da fluorescência de fundo.
- Limitado a leituras fluorescentes; incompatível com corantes suscetíveis à quenchagem ou compostos que interferem na excitação/emissão do Fluo-4 AM.
