Imagens de alta resolução de receptores de neurotransmissores em sinapses retinianas

Faça uma seção de retina de camundongo em uma grade de microscopia eletrônica. A seção contém células ganglionares da retina, ou RGCs, sinapticamente ligadas a células bipolares. As

células bipolares pré-sinápticas contêm vesículas de neurotransmissores dispostas em uma estrutura de fita perto da membrana sináptica.

Os

RGCs pós-sinápticos exibem receptores de neurotransmissores agrupados em sua membrana. Essas células são marcadas com a subunidade B ou CTB da toxina da cólera. Lave

com um tampão para manter o pH.

Incube com um buffer de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incubar com anticorpos primários direcionados aos receptores de neurotransmissores e CTB.

Lave com um tampão para remover anticorpos não ligados e manter o pH.

Incubar com anticorpos secundários conjugados a nanopartículas de ouro de diferentes tamanhos, que se ligam aos anticorpos primários, marcando as moléculas-alvo. Remova os

anticorpos não ligados e seque a amostra ao ar.

Aplique metais pesados que ligam macromoléculas, aumentando o contraste.

Usando microscopia eletrônica, identifique os RGCs usando os CTBs marcados e localize os receptores de neurotransmissores marcados.

Nesta etapa, corte seções ultrafinas de 70 nanômetros de espessura com um ultramicrótomo e colete-as nas grades de níquel revestidas de carbono Formvar. Lave as grades em água destilada uma vez, seguida de três lavagens de TBS. Em seguida, incube as grades em 20 microlitros de BSA a 5% em TBS por 30 minutos e, em seguida, em 20 microlitros de uma mistura contendo anti-CTB de cabra e um anticorpo para uma subunidade NMDAR durante a noite em temperatura ambiente.

Depois disso, lave as grades três vezes com 20 microlitros de TBS de cada vez em pH 7,6. Em seguida, lave as grades uma vez com TBS em pH 8,2 por cinco minutos. Incube as grades por duas horas com 20 microlitros de uma mistura contendo IgG anti-coelho de burro, acoplada a partículas de ouro de 10 nanômetros, e IgG anti-cabra de burro acoplada a partículas de ouro de 18 nanômetros.

Após duas horas, lave as grades em 20 microlitros de TBS a pH 7,6 três vezes, seguido de uma lavagem em água ultrapura. E então seque as grades ao ar. Em seguida, contra-core as grades com acetato de uranila a 5% em água destilada por oito minutos, seguido de citrato de chumbo a 0,3% em água destilada por cinco minutos no escuro.