Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:52 min. • April 28th, 2025
Comece com uma placa de vários poços contendo células de mamíferos recombinantes aderentes em uma solução de estimulação suplementada com luciferina, um substrato luminescente.
Incubate para permitir a entrada de luciferina na célula.
Essas células expressam receptores de odor ligados à membrana acoplados a proteínas G olfativas e proteínas transportadoras de receptores.
Além disso, as células expressam proteínas Glosensor citoplasmáticas, proteínas luminescentes sensíveis ao AMP cíclico.
Adicione uma solução odorizante vaporizável no espaço entre os poços e coloque a placa dentro de um instrumento luminômetro pré-equilibrado com o mesmo odorante.
Inicie a medição de luminescência.
As moléculas odoríferas ligam-se aos receptores odoríferos das células, ativando a proteína G acoplada e dissociando a subunidade α da proteína G, ou Gα.
A subunidade Gα dissociada liga-se à enzima adenilato ciclase incorporada na membrana, ativando-a. A enzima ativada converte os ATPs em AMPs cíclicos.
Esses AMPs cíclicos se ligam a proteínas glossensoras, alterando sua conformação e permitindo a ligação da luciferina.
Essa interação produz luminescência, confirmando a ativação de receptores de odor.
Adicione 75 microlitros da solução reagente cAMP. Remova a solução de estimulação dos poços e adicione 25 microlitros de solução reagente cAMP diluída a cada poço. Incube a placa de 96 poços à temperatura ambiente em um ambiente escuro e livre de odores por duas horas.
Primeiro, dilua o odorante acetofenona a 1% em 10 mililitros de óleo mineral e tampe o tubo. Antes do final do tempo de incubação do reagente cAMP, adicione 25 microlitros da solução odorífera a cada poço em uma nova placa de 96 poços. Em seguida, coloque esta placa de odor na câmara do luminômetro por cinco minutos para equilibrar a câmara com moléculas de odor voláteis. Configure o luminômetro para registrar a luminescência com zero segundos de atraso durante 20 ciclos de medição de placa de 90 segundos, com 0.7 segundos de intervalo entre os ciclos.
Logo antes de ler a placa, remova a placa de odor da câmara. Na placa de 96 poços contendo as células transfectadas, adicione 25 microlitros de odor no espaço entre os poços e coloque rapidamente a placa de volta na câmara. Inicie a medição de luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 minutos.