JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 4:38 min • April 28th, 2025
Comece com um rato anestesiado.
Faça uma incisão na linha média da pele entre as vértebras C2 cervicais e T2 torácicas.
Em seguida, faça uma incisão ao longo da linha média do tecido fibroso branco e retraia a primeira camada muscular.
Disseque o tecido membranoso fino na linha média da segunda camada muscular e, em seguida, retraia os músculos longitudinais estriados.
Finalmente, faça uma incisão na terceira camada muscular para expor a coluna vertebral.
Remova a lâmina e o pedículo que recobrem as vértebras esquerdas de C4 a T1 para revelar os gânglios da raiz dorsal de C5 a C8 ou DRGs.
Injete uma suspensão viral adeno-associada recombinante nos DRGs.
O vírus codifica uma proteína promotora de crescimento que auxilia na regeneração axonal.
Usando uma pinça, esmague as raízes dorsais de C5 a C8 para cortar as conexões axonais do DRG à medula espinhal, criando uma lesão axonal controlada.
O modelo está pronto para estudar a regeneração axonal mediada por vírus.
Comece a cirurgia localizando os processos espinhosos proeminentes de C2 e T2 sobre a pele. Em seguida, use um bisturi número 10, para fazer uma incisão na pele entre os processos espinhosos C2 e T2. Uma vez que a pele é aberta, uma linha média de tecido fibroso branco deve ser visível na primeira camada do músculo, que tem uma textura gelatinosa.
Faça uma incisão de tamanho semelhante na primeira camada de músculo ao longo da linha média branca. Não vá além do processo espinhoso T2 proeminente, pois há um grande vaso sanguíneo localizado perto dele. Retraia a primeira camada de músculo usando dois afastadores, um colocado rostralmente e outro caudalmente.
A segunda camada de músculo com aparência estriada agora deve ser visível. Localize a linha média da segunda camada de músculo, onde dois músculos longitudinais podem ser observados, conectados por um tecido membranoso fino. Em seguida, use uma microtesoura para dissecar o tecido membranoso e separar os dois músculos longitudinais.
Ajuste os retratores para expor a terceira camada de focinho fino que cobre a coluna. Os processos espinhosos podem ser sentidos tocando levemente com uma pinça sobre a terceira camada do músculo. Use uma microtesoura para fazer uma pequena incisão na terceira camada do músculo. E raspe suavemente o músculo do osso usando uma cureta ou bisturi de lado para expor claramente as vértebras.
Para expor os DRGs C5 a C8 esquerdos, use um par de rongeurs finos para realizar uma hemilaminectomia esquerda nas vértebras C4 a T1, removendo cuidadosamente parte da lâmina e do pedículo. Uma vez que uma quantidade suficiente de DRG tenha sido exposta para injeção, prepare a seringa colocando a seringa de microlitro cheia de vírus equipada com uma agulha romba de calibre 33 feita sob medida no suporte da seringa estereotáxica. Em seguida, use uma agulha chanfrada de calibre 30 para fazer uma pequena abertura superficial em cada um dos DRG direcionados para auxiliar na inserção da agulha de injeção. Ajuste suavemente as coordenadas estereotáxicas para inserir a agulha de calibre 33 no centro do DRG.
Idealmente, a agulha deve ser colocada bem no centro do DRG para garantir a difusão uniforme da solução injetada por todo o DRG.
Assim que a agulha for inserida, use a bomba de seringa de infusão para injetar 1 microlitro do vírus em cada DRG. Durante a injeção, o DRG mudará lentamente de cor se a solução do vírus contiver um corante colorido. Não insira demais a agulha, pois isso pode causar vazamento de fluido do lado ventral do DRG.
Caso ocorra vazamento durante a injeção, ajuste a posição da agulha imediatamente. Três minutos após o final da injeção, retire a agulha de injeção. Para realizar uma lesão simultânea por esmagamento da raiz dorsal de C5 a C8, esmague cada raiz três vezes por 10 segundos usando um par de pinças de ponta fina. Oponha-se completamente às extremidades da pinça. Uma linha branca no tecido deve aparecer no local do esmagamento.