Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:15 min. • April 28th, 2025
Pegue uma lâmina com câmara contendo uma cultura de monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro de rato, ou RBMECs, imitando a camada de células endoteliais da barreira hematoencefálica.
As células exibem proteínas de junção apertada interrompidas e fibras de estresse de actina devido ao estresse da privação de oxigênio-glicose seguida de reoxigenação.
Remova o meio e lave as células, aplique um fixador para preservar a arquitetura celular e, em seguida, lave o excesso de fixador.
Trate com um detergente para permeabilizar as membranas celulares.
Incube com um agente bloqueador para mascarar locais de ligação não específicos.
Para rotular proteínas de junção apertada, incubar com anticorpos primários específicos e, em seguida, remover anticorpos não ligados.
Incube com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para rotular os anticorpos primários.
Alternativamente, para rotular as fibras de estresse, adicione faloidina marcada com fluoróforo.
Lave para remover moléculas de marcação não ligadas.
Remova a câmara, aplique um meio de montagem contendo um corante fluorescente de ligação ao DNA para manchar os núcleos e, em seguida, sele com uma lamínula.
Usando microscop
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