Localização de fluorescência de proteínas de junção apertada e fibras de estresse em células endoteliais

Pegue uma lâmina com câmara contendo uma cultura de monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro de rato, ou RBMECs, imitando a camada de células endoteliais da barreira hematoencefálica.

As células exibem proteínas de junção apertada interrompidas e fibras de estresse de actina devido ao estresse da privação de oxigênio-glicose seguida de reoxigenação.

Remova o meio e lave as células, aplique um fixador para preservar a arquitetura celular e, em seguida, lave o excesso de fixador.

Trate com um detergente para permeabilizar as membranas celulares.

Incube com um agente bloqueador para mascarar locais de ligação não específicos.

Para rotular proteínas de junção apertada, incubar com anticorpos primários específicos e, em seguida, remover anticorpos não ligados.

Incube com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para rotular os anticorpos primários.

Alternativamente, para rotular as fibras de estresse, adicione faloidina marcada com fluoróforo.

Lave para remover moléculas de marcação não ligadas.

Remova a câmara, aplique um meio de montagem contendo um corante fluorescente de ligação ao DNA para manchar os núcleos e, em seguida, sele com uma lamínula.

Usando microscopia confocal, visualize as proteínas de junção apertada marcadas com fluorescência e as fibras de tensão.

Comece expondo cada poço de monocamadas RBMEC a 100 a 200 microlitros de meio de soro reduzido Opti-MEM e continue sua incubação por uma hora. Em seguida, lave as lâminas da câmara três vezes, usando 100 a 200 microlitros de PBS por poço por lavagem. Fixe as células com paraformaldeído a 4% em PBS e incube as lâminas por 15 minutos em temperatura ambiente. E lave as células três vezes com PBS como antes.

Agora, permeabilize as células aplicando 100 a 200 microlitros de Triton X-100 a 0,5% em PBS em cada poço. E deixe a placa incubar por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Depois que as células forem permeabilizadas, aplique a solução de bloqueio. E deixe isso agir nas células por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, execute a imunofluorescência para a proteína ZO-1 ou rotule a F-actina. Para conduzir a imunofluorescência das células para ZO-1, incube-as com o anticorpo primário durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave as células três vezes em PBS, como ao remover o fixador. Em seguida, incube as células em 100 a 200 microlitros de anticorpo secundário anti-coelho FITC tag por uma hora em temperatura ambiente, para marcar as células com rodamina faloidina.

Após aplicar a solução de bloqueio por uma hora, expor as células a 100 a 200 microlitros de rodamina faloidina em uma diluição de 1 a 50, com 2% de BSA PBS por 20 minutos. Após a incubação do anticorpo secundário ou da faloidina da rodamina, lave as células com PBS três vezes novamente como antes. Em seguida, remova as câmaras retirando o elástico. Prossiga com a montagem dos slides, usando um meio contendo antifade e DAPI. Visualize as células com microscopia confocal em um único plano com uma objetiva de 60x.