Um modelo mínimo de lesão medular para estudar a ativação e migração de células-tronco neurais

Pegue um rato anestesiado e raspe suas costas.

Prenda-o em um dispositivo estereotáxico, com gaze enrolada posicionada para apoiar a coluna torácica.

Desinfete a pele, faça uma incisão vertical na linha média e retraia a pele.

Retire os tendões musculares da coluna torácica e retraia-os.

Identifique a vértebra alvo e, em seguida, corte as articulações intervertebrais para removê-la.

Exponha a medula espinhal e insira uma agulha dobrada em ambos os lados da linha média.

A inserção da agulha cria lesões superficiais na substância branca, a camada externa da medula espinhal contendo feixes de axônios, deixando o canal central intacto.

Remova a agulha e suture os músculos e a pele.

As células danificadas liberam sinais que ativam as células imunes residentes no tecido, que por sua vez ativam as células-tronco neurais, ou NSCs, ao redor do canal central.

NSCs ativados migram para o local da lesão, auxiliando no reparo tecidual.

Antes de iniciar o procedimento, use uma máquina de cortar cabelo para remover o pelo do dorso de um camundongo anestesiado do meio das costas até o pescoço e as orelhas. Depois de prender o mouse em um dispositivo estereotáxico, coloque quatro a cinco pedaços de gaze enrolada sob o abdômen, enquanto puxa levemente a base da cauda para endireitar o corpo e a coluna.

Empurre o rolo de gaze torácica rostralmente do abdômen do camundongo em direção à parte superior do tórax para apoiar a coluna torácica. E use fita adesiva de laboratório para prender a cauda e os membros em uma orientação semelhante a uma estrela. Após desinfetar a pele exposta com swabs sequenciais de etanol a 70% e iodopovidona, use uma lâmina de bisturi número 10 para fazer uma incisão vertical paralela ao eixo longitudinal do animal, do ponto médio de ambas as omoplatas até a curvatura da coluna torácica.

Retraia a pele para expor o tecido mole e o contorno da coluna vertebral e identifique a borda inferior do coxim adiposo supraescapular. Em seguida, use o bisturi para cortar com cuidado, mas com força, ao longo de ambos os lados dos ossos vertebrais T5 a T8 e 9 para separar os tendões musculares das costas da coluna vertebral. Reposicione os afastadores de modo que os dentes dos afastadores sejam inseridos no local da incisão em ambos os lados da coluna e expanda cada afastador para ajustar a exposição até que a coluna esteja suficientemente elevada, sem sobrecarregar as camadas musculares retraídas.

Sob um microscópio cirúrgico, limpe cuidadosamente o músculo residual e outros tecidos moles que recobrem a coluna vertebral para expor o osso vertebral, apertando o processo espinhoso das vértebras com uma pinça dentada e movendo a pinça levemente para cima e para baixo para identificar as vértebras que serão removidas. Em seguida, insira uma ponta de uma tesoura curva e embotada em cada lado do forame intervertebral exposto, caudal à lâmina vertebral a ser excisada, e corte as articulações intervertebrais de conexão bilateralmente. Em seguida, levante a lâmina para cima e corte a fixação superior da lâmina para isolar e remover o osso.

Ao cortar e remover a lâmina vertebral, tome cuidado para sempre inclinar a tesoura para cima, para não danificar a medula espinhal subjacente.

Com a veia da linha média dorsal servindo como ponto de referência, insira a haste dobrada de 45 graus de uma ponta de agulha de calibre 30 com o lado chanfrado para cima, 1 milímetro de profundidade na superfície dorsolateral da medula espinhal e aproximadamente 0,5 milímetros laterais de cada lado da linha média. Mova a agulha cerca de dois milímetros da direção caudal para a rostral, de modo que todo o comprimento do chanfro seja inserido no cordão. Em seguida, refaça o caminho da entrada para remover a agulha.

Para fechar a ferida, remova o afastador e use uma sutura absorvível 6-0 para unir os músculos das costas em ambos os lados da lesão ao longo da linha média e uma sutura de seda 4-0 para fechar a pele sobrejacente.