Realização de imuno-histoquímica em tecido cerebral de primatas não humanos

Comece com uma seção cerebral de primatas não humanos quimicamente fixada.

O fixador à base de aldeído reticula proteínas, preservando a estrutura do tecido, mas deixa alguns resíduos de aldeído reativos.

Lave para remover a camada crioprotetora ao redor da seção de tecido.

Adicione um agente redutor para neutralizar os grupos aldeídos reativos, produzindo subprodutos de reação.

Lave para remover esses subprodutos e excesso de agentes redutores.

Aplique uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Adicione anticorpos primários direcionados a uma proteína expressa em locais específicos da membrana neuronal.

Lave para remover anticorpos não ligados.

Adicione anticorpos secundários biotinilados direcionados aos anticorpos primários.

Lave para remover os anticorpos não ligados.

Sobreponha com complexos avidina-biotina-peroxidase que se ligam aos anticorpos secundários.

Lave novamente para remover os complexos não ligados.

Introduza um substrato cromogênico junto com peróxido de hidrogênio. Na presença de peróxido de hidrogênio, a enzima peroxidase oxida o substrato, formando precipitados marrons.

Comece transferindo seções de 50 mícrons de espessura do cérebro de primata não humano fixado com acroleína, contendo a região de interesse para uma placa de 12 poços contendo PBS. Lave as seções flutuantes três vezes em PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, incubar as secções em solução de boro-hidreto de sódio recentemente preparada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Balance suavemente sem tampa.

Decorridos os 30 minutos, aspirar o borohidreto de sódio e adicionar PBS a cada poço. Coloque o prato em uma cadeira de balanço e agite vigorosamente por 10 minutos. Repita a lavagem mais duas vezes ou até que não reste nenhum gás de reação. Bloqueie as seções incubando em uma solução de soro normal a 2% e gelatina de peixe fria a 0,5%, diluída em PBS por uma hora em temperatura ambiente com balanço suave.

Decorrido o tempo de incubação, incubar as secções e a solução de anticorpos primários com um balanço suave durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, depois de lavar as seções como antes, incubar as seções em solução de anticorpos secundários por 1,5 horas em temperatura ambiente com balanço suave. Depois de lavar as seções como antes, incubar em avidina biotina peroxidase, ou solução ABC, por uma hora com balanço.

Em seguida, prepare uma nova solução de 3,05% de 3,3-diaminobenzidina com 0,005% de peróxido de hidrogênio diluído em TBS. Após a lavagem, incube as seções na solução DAB por três a sete minutos com um balanço suave. Assim que o precipitado marrom atingir a cor desejada, pare a reação lavando rapidamente duas vezes em TBS frio e, em seguida, por meio de uma série de lavagens cronometradas de TBS e PB.