Coloração imuno-histoquímica de criossecções de tecido coronal de rato para microglia e neurônios

Pegue uma lâmina contendo criosecções de tecido coronal de rato fixo e permeabilizado.

Contorne as seções com uma caneta hidrofóbica para criar um ambiente de coloração controlado.

Transfira as seções para uma câmara de umidade para evitar o ressecamento de reagentes e tecidos durante as etapas subsequentes.

Trate as seções com proteínas séricas para bloquear locais de ligação não específicos.

Enxágüe com tampão para remover o excesso de proteínas séricas.

Incubar com anticorpos primários direcionados a proteínas específicas na microglia e nos neurônios.

Lave com tampão para remover anticorpos primários não ligados.

Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.

Lave com tampão para remover anticorpos secundários não ligados. Em seguida, enxágue com água bidestilada

Aplique um meio de montagem aquoso para proteger o sinal fluorescente, coloque uma lamínula e feche-a.

Visualize as seções sob um microscópio de fluorescência para visualizar microglia e neurônios imunomarcados.

Seque as bordas das lâminas e faça uma borda repelente de líquidos ao redor da borda da lâmina com uma caneta de papanicolau, para garantir uma cobertura uniforme do líquido e reduzir os efeitos de borda. Em seguida, bloqueie as seções adicionando 300 microlitros de soro em PBS a cada lâmina. O soro deve ser da espécie em que o anticorpo secundário é criado. Neste caso, foi utilizado soro de burro.

Certifique-se de que a solução de bloqueio se estenda até a borda da lâmina e cubra completamente o tecido para evitar manchas irregulares. Coloque as lâminas em uma câmara de umidade para incubar em temperatura ambiente, por uma hora. Durante a incubação, prepare os anticorpos primários. Dilua o anticorpo IBA1, 1 a 5.000 e o anticorpo pan-neuronal, 1 a 500 em uma mistura de soro de burro a 1% em PBS.

Remova a solução de bloqueio e adicione 300 microlitros da solução de anticorpos, que contém os dois anticorpos de interesse. Coloque todas as lâminas em uma câmara de umidade e incube-as durante a noite a 4 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada.

Prepare a mistura de anticorpos secundários fluorescentes, diluindo ambos de 1 a 250, em soro de burro a 1% em PBS. Adicione 300 microlitros da mistura em cada lâmina. E coloque as lâminas em uma câmara de umidade leve e apertada por 60 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas três vezes em PBS por cinco minutos cada. E, finalmente, enxágue-os em água bidestilada Proteja as lâminas da luz durante a lavagem em PBS.

Adicione algumas gotas de um meio de montagem aquoso, que ajuda a preservar a intensidade do sinal de fluorescência para cada lâmina. Em seguida, cubra a lâmina e remova as bolhas de ar restantes usando um aplicador com ponta de algodão. Para selar a mídia de montagem nas corrediças e evitar que as seções sequem, cubra as bordas com esmalte. As lâminas são deixadas para secar por uma hora em uma caixa protegida contra a luz, antes de serem armazenadas em um recipiente leve e apertado, embrulhado em papel alumínio a 4 graus centígrados.