Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Pegue um slide com seções embebidas em parafina de neuroesferas de tumores cerebrais, aglomerados de células-tronco neurais exibindo biomarcadores de proteínas nucleares específicas do tumor.

Aqueça para derreter a parafina, remova-a usando xileno e reidratie o tecido usando concentrações decrescentes de álcool.

Aqueça em um tampão ácido contendo detergente para desmascarar epítopos nos biomarcadores e permeabilizar as membranas celulares.

Enxágüe e trate com um agente oxidante para inativar as enzimas peroxidase endógenas, evitando sinais inespecíficos.

Aplique uma solução de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incube com anticorpos primários direcionados aos epítopos dos biomarcadores.

Enxágue e trate com anticorpos secundários conjugados com biotina que se ligam aos anticorpos primários.

Enxágue e incube com uma avidina conjugada com enzima peroxidase, que se liga à biotina.

Adicione um substrato cromogênico e um agente oxidante.

A peroxidase utiliza o agente para converter o substrato em precipitados coloridos, rotulando a localização do biomarcador.

Contra-core os núcleos, desidrate o tecido em álcool e monte a lâmina para obter imagens da distribuição do biomarcador.

Primeiro, derreta a parafina incubando as lâminas em uma prateleira de metal a 60 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, desparafinizei as lâminas via incubação em um trem de reidratação à temperatura ambiente de acordo com o protocolo Tex. Armazene as lâminas em água da torneira para evitar a ligação inespecífica de anticorpos. Depois disso, incube as lâminas em tampão citrato a 125 graus Celsius por 30 segundos a 90 graus Celsius por 10 segundos. Deixe as lâminas esfriarem antes de enxaguá-las cinco vezes com água destilada.

Em seguida, incube as lâminas à temperatura ambiente em peróxido de hidrogênio a 0,3% por 20 minutos. Em seguida, lave as lâminas por cinco minutos três vezes em tampão de lavagem com agitação suave. Incube as lâminas durante a noite em uma câmara umidificada ajustada para 4 graus Celsius com anticorpo primário diluído. Depois disso, lave as lâminas três vezes por cinco minutos com agitação suave.

Em seguida, incubar as lâminas em anticorpo secundário biotinilado diluído à temperatura ambiente durante uma hora. Lave as lâminas três vezes por cinco minutos em tampão de lavagem com agitação suave. Em seguida, incubar as lâminas no complexo peroxidase de rábano biotinilado avidina à temperatura ambiente no escuro durante uma hora. Repita a lavagem conforme descrito anteriormente. Depois disso, incube as lâminas com bandas de substrato de peróxido de hidrogênio por dois a cinco minutos em temperatura ambiente.

Enxágue as lâminas com água da torneira e mergulhe-as em solução de hematoxilina para contracorá-las. Em seguida, enxágue bem as lâminas em água da torneira até que a água saia limpa. Desidrate as lâminas de acordo com o protocolo Tex. Por fim, cubra as lâminas com um meio de montagem à base de xileno e deixe-as secar em uma superfície plana à temperatura ambiente.