Name: Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprenda a isolar DNA viral de alta pureza a partir de nucleocapsídeos de herpesvírus usando ultracentrifugação e extração com fenol-clorofórmio. Este método permite obter DNA concentrado e livre de contaminação.

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Os autores agradecem as contribuições de Greg Smith, Pomeranz Lisa, Matt Lyman, Eldridge Marlies, Staniszewska Halina Goraczniak, e os membros do laboratório Enquist in fine-tuning protocolo isso.

1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers <ol><li> Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV). </li><li> Quando as células são 95 - confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. Placas de rocha suavemente a cada 15 minutos para garantir que a monocamada de células permanece totalmente revestida pela inóculo do vírus. Enquanto isso, aqueça o meio para a próxima etapa. </li><li> Após uma hora de infecção, aspirado inóculo viral das placas, adicione 15 ml de meio quente, e incubar a 37 ° C por 12-20 horas em uma incubadora umidificada. </li><li> Prepare buffers LCM (ver Tabela 1) e rock durante a noite a 4 ° C para homogeneização da mistura. Prepare TNE para a ressuspensão de DNA viral (ver Tabela 2). </li></ol> 2. Segundo dia, Fase 1: Lise Celular e Ultracentrifugação <ol><li> Confirmar visualmente que a infecção de células causou efeito citopático uniforme (CPE). Permitir a infecção progredindo até que todas as células têm arredondado para cima, mas ainda não decolou no prato. </li><li> Raspe as células infectadas no meio, e combinar as células e médio em 50 ml tubos cônicos. O número de tubos cônicos necessários para esta etapa vai depender do número de pratos utilizados para a infecção no Passo 1.2 acima, por exemplo, um tubo de 50 ml cônica pode ser usado para pellet um máximo de 3 pratos de 15 ml de meio de cada Opcional:. Lave o placas com 10 ml de PBS e combinam com as células e médias empresas. </li><li> Células centrífuga e médio por 10 minutos a 2000 centifugal força relativa (RCF) em temperatura ambiente, em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS. Se o pellet de uma infecção viral foi espalhada em vários tubos cônicos na Etapa 2.2, estes podem ser recombinados em um tubo cônico nesta etapa. Repetir a centrifugação e aspiração Opcional:. Este pellet podem ser armazenadas a -20 ° C e do protocolo continuou em um momento posterior. </li></ol> 3. Segundo dia, Fase 2: Ultracentrifugação Mantenha o pellet celular e buffers LCM no gelo sempre que possível durante as etapas seguintes. <ol><li> Adicionar β-mercaptoetanol para 0% de glicerol - buffer de LCM. Começar a resfriar a ultracentrífuga (para o passo 3.9), definindo-a 4 ° C e ligar o vácuo. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 5 ml de glicerol 0% - tampão LCM até que não é mais clumpy. Se necessário, o tubo de vórtice para quebrar qualquer célula não dissolvido pellet. </li><li> Extrato, adicionando 1,5 ml Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vórtex vigorosamente. Imediatamente centrifugar por 10 min a 2000 rcf a uma temperatura de 4 ° C. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande furo (evitando a interface) e transferir para um novo tubo Opcional:. Se o pellet é um sólido gelatinoso, você pode rapidamente despeje a camada superior para um tubo novo. </li><li> Repetir a extracção Freon e centrifugar novamente. </li><li> Coletar a camada superior (~ 5 ml) e transferir para um novo tubo polyallomer ultracentrífuga. Adicionar β-mercaptoetanol para o glicerol dois restantes - buffers LCM. </li><li> Prepare um gradiente no tubo de ensaio polyallomer por underlaying o extrato Freon (camada superior) com 3 ml de glicerol 5% - LCM (camada intermediária), e depois underlaying novamente com 2,5 ml de glicerol 45% - LCM (camada inferior). Use uma pipeta fina para evitar o transbordamento do conteúdo do tubo. </li><li> Se necessário, prepare um tubo de equilíbrio equivalente usando as mesmas proporções de buffers LCM. </li><li> Transferência de tubos em baldes ultracentrífuga. Equilíbrio baldes para dentro de 0,1 g do outro, suavemente adicionando glicerol 0% extra - buffer de LCM para a camada superior (~ 5-10 mL de cada vez). </li><li> Usando uma ultracentrífuga frio com um rotor horizontal balde ou balançando, spin amostras equilibrada durante 1 hora a 77.000 rcf (por exemplo, 25.000 rpm para um rotor SW41Ti) a uma temperatura de 4 ° C. </li><li> Durante ultracentrifugação, fazer um gancho para capturar DNA de vidro flutuante na etapa de precipitação de etanol (4.6). Segure ambas as extremidades de uma pipeta Pasteur de vidro e suspender a parte do meio sobre uma chama. Quando uma seção de vidro é quase derretido, retire com cuidado para esticar o copo, dobre-o suavemente para criar um gancho bem anguladas (&lt;90 graus), e puxe bruscamente para selar o fim. Se a ponta do anzol de vidro está aberto, segure a ponta sobre a chama para que o vidro derrete o suficiente para a fechar. </li><li> Após a ultracentrifugação, você deve ver uma fina opaco pellet com uma mancha escura no meio. Aspirar cuidadosamente o líquido do tubo, incluindo drippings ao longo dos lados, mas evitando a pelota no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 0,5 ml TNE em temperatura ambiente. </li><li> Deixe o pellet sentar-se por pelo menos 10 minutos para permitir a hidratação do sedimento. Optional: O pellet também pode ressuspender em TNE durante a noite, se for mantida a 4 ° C. </li></ol> 4. Terceiro Dia: "Ghost" Precipitação DNA <ol><li> Quebrar o pellet por pipetagem com uma ponteira de pequeno calibre (por exemplo, um p200 ponta da pipeta). Não se preocupe com corte nesta etapa, porque o DNA viral ainda está contida em capsídeos neste momento. Adicionar os reagentes a seguir ao tubo contendo o pellet viral, à temperatura ambiente, para destruir capsídeos: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml SDS 10% </li><li> 2 mg de proteinase K </li></ul> Agite levemente para misturar estes reagentes. Deve haver um ligeiro aumento na viscosidade. </li></ol> Cuidado com corte a partir de agora, por exemplo, uso de grande calibre pipetas e não vortex o material viral <ol start="2"><li> Extrato de proteínas virais, adicionando 5 ml de fenol-clorofórmio e imediatamente começar a inverter ou vórtex para manter uma emulsão. Misture por 10 segundos, em seguida, centrifugar a emulsão de 5 minutos a 2000 rcf à temperatura ambiente. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande diâmetro, evitando a interface, e transferir para um novo tubo Opcional:. Use fase de bloqueio de gel (PLG) tubos nesta etapa para evitar a contaminação a partir da interface. </li><li> Repita a extração fenol-clorofórmio e centrifugar novamente. </li><li> Após a extração do fenol-clorofórmio segundo, coletar a camada superior em um vidro de 30 ml tubo Corex e descontrair o tubo a -20 ° C por 10-15 minutos, tomando cuidado para que não congela. </li><li> Adicionar 10 ml de etanol gelado, cobrir o tubo (por exemplo, que se estende um pedaço de Parafilm M sobre a parte superior), e inverta para misturar imediatamente. Assistir a um DNA "fantasma" para aparecer, que consiste de um precipitado ropy fina. Inverter o tubo suavemente para misturar mais e fazer com que o DNA sticky precipita a se agrupar. </li><li> Use um gancho de vidro para capturar o fantasma DNA (s). Cuidadosamente blot o DNA para remover o excesso de líquido, em seguida, coloque o gancho (ponta para baixo) em um tubo de 1,5 ml e deixar secar. Adicionar ,25-,5 ml de TE para dissolver o fantasma DNA. Permitir a ressuspensão de DNA para continuar por pelo menos uma hora. DNA armazenar a 4 ° C. Opcional: Para maximizar o rendimento de DNA, romper o gancho de vidro dentro do tubo de 1,5 ml, de modo que a ressuspensão fora os fragmentos de vidro podem continuar ao longo do tempo. </li></ol> 5. Resultados representante Com uma alta suficientemente MOI, as células devem atingir CPE total dentro ~ infecção pós 18 horas (hpi) para as estirpes do tipo selvagem PRV, e ~ hpi 24 para tipo selvagem HSV-1 amostras (Figura 1). Uma vez que o pellet celular infectado é colhido, os passos do protocolo restante pode ser completa em um dia inteiro ou realizadas durante dois dias (Figura 2). Ao preparar anzóis de vidro para capturar o fantasma DNA, é importante fazer o ângulo de gancho ser inferior a 90 graus, para que mais tarde pode caber na base de um tubo de 1,5 ml (Figura 3). Vedação a ponta deste gancho impede a perda de DNA no interior da pipeta. Fantasmas DNA formam durante a etapa de precipitação e vai aparecer como o branco, threads ropy (Figura 4). Estes agregados e ficar uns aos outros e / ou o gancho de vidro usado para capturar o DNA. Assim, o gancho mesmo vidro pode ser usado para juntar vários segmentos de DNA a partir da solução de precipitação. <table border="1"><tbody><tr><td> Escolha coluna com base no volume desejado: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> KCL 1M </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 ml </td><td> 450 mL </td><td> 600 mL </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 </td><td> 10 ml </td><td> 15 mL </td><td> 20 l </td><td> 40 mL </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol (adicione imediatamente antes da utilização) </td><td> 4,3 mL </td><td> 6,5 mL </td><td> 8,6 mL </td><td> 17,2 mL </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Use proporções nas pesquisas de glicerol por cento desejado (0, 5 ou 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glicerol </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> água </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> Glicerol 5% </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Receitas para a preparação de buffers LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Para 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ml de EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Para 1 volume L </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O para 1L </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Preparação de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Células PK15 (A) antes da infecção, (B) no meio de infecção, e (C) no efeito citopático (CPE), depois de uma multiplicidade de infecção. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visão geral do protocolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Três exemplos representativos de vidro ganchos utilizados para recolher os fantasmas DNA viral. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Exemplo representativo de uma bem-formados e abundantes de DNA "fantasma".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. 4 Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. 7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semelhantes são comument...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique com sua instituição, para obter orientações sobre o descarte adequado de resíduos contendo Freon, ou ver Mendez et al. de alternativas Freon potencial 9. </td></tr><tr><td> Bloqueio fase de tubos de gel, capacidade de 15ml Pesada </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga tubos Polyallomer </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecione tubos apropriados para o seu próprio ultracentrífuga, que são incluídas apenas como exemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 células </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de dna viral a partir nucleocapsids

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. 1,2, 3 Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. 4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de 260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections. Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 6 células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. 6 Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm). Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Os vírus são parasitas celulares obrigatórios e, portanto, o estudo do seu DNA requer o isolamento do material viral de contaminantes e do DNA da célula hospedeira. ...

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar nucleocapsídeos virais e DNA de alta pureza a partir de células infectadas. Primeiramente, as membranas lipídicas são desnaturadas utilizando uma extração com dupla centrifugação em gradiente de sacarose. Em seguida, a amostra é submetida à ultracentrifugação para formar um pellet dos nucleocapsídeos virais e separá-los dos componentes celulares e virais mais leves.São adicionados detergentes e protease K para liberar o DNA viral dos nucleocapsídeos em pellet. Em seguida, são realizadas extrações duplas com fenol-clorofórmio para remover todas as proteínas remanescentes. Por fim, o DNA viral é precipitado em solução.Por fim, os resultados mostram que o DNA viral altamente concentrado e puro foi isolado dessas células infectadas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que não envolvem extrações livres de enzimas ou ultracentrifugação, é que o DNA viral produzido aqui apresenta níveis muito baixos de contaminação por DNA do hospedeiro, tornando-o ideal para procedimentos posteriores, como PCR e sequenciamento profundo de genomas virais. Utilizamos este método pela primeira vez nos primórdios do trabalho com DNA recombinante, quando medidas preventivas adicionais tinham grande importância.Desenvolvemos este procedimento para isolar DNA viral enquanto trabalhávamos em uma caixa de luvas sob condições BSL quatro. A demonstração visual deste método é essencial porque a formação do gradiente e as etapas de precipitação do DNA são difíceis de aprender. Isso ocorre porque a aplicação em camadas do gradiente exige uma mão extremamente firme e o precipitado de DNA que se forma na solução pode ser difícil de visualizar caso você não tenha experiência prévia em identificá-lo.Inicie este procedimento preparando cinco a dez placas de 15 centímetros de diâmetro com células de cultura tecidual para infecção. Neste caso, células PK 15 são preparadas para infecção com o vírus da pseudorraiva quando as células estiverem com 95 a 100% de confluência; substitua o meio por quatro mililitros de meio contendo o vírus. Com uma MOI de cinco a 10, incube as placas por uma hora em um incubador úmido a 37 graus Celsius com 5% de CO₂, agitando a cada 15 minutos.Balançar suavemente as placas para garantir que a monocamada celular permaneça completamente recoberta pelo inóculo viral. Durante a incubação, aquecer o meio para o próximo passo. Após uma hora de infecção, aspirar o inóculo viral das placas.Em seguida, adicione 15 mililitros de meio morno e incube a 37 graus Celsius por 12 a 20 horas em um incubador umidificado. Por fim, em preparação para os experimentos do dia seguinte, prepare um novo lote de tampões LCM e TNE. Observe que a adição de NP 40 resultará na formação de fitas na solução de aquisição.Coloque as soluções preparadas em um agitador rotoreso a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, as soluções devem estar completamente integradas. Coloque a placa no estágio de um microscópio composto e confirme visualmente que a infecção das células causou um efeito citopático uniforme.Todas as células devem estar arredondadas, mas ainda não devem ter se destacado da placa. Se as células ainda não estiverem arredondadas, continue a incubação até que os efeitos citopáticos sejam observados. Em seguida, raspe as células infectadas para o meio e reúna as células no meio em tubos cónicos de 50 mililitros para aumentar o rendimento.Lave as placas com 10 mililitros de PBS e combine com as células no meio, em seguida centrifugue as células e o meio por 10 minutos a 2000 RCF à temperatura ambiente para remover qualquer meio e soro remanescentes; aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS. Repita a centrifugação e a aspiração. Se o experimento não for continuado no mesmo dia, armazene o pellet a menos 20 graus Celsius até que seja utilizado nas etapas mostradas nesta seção.É importante manter o pellet celular e os tampões LCM sempre que possível em gelo. Prepare-se para a ultracentrifugação adicionando etanol Beamer capto ao tampão LCM com 0% de glicerol, de modo que a concentração final de etanol Beamer capto seja 0,043%. Prepare também o ultracentrífugo ajustando-o para quatro graus Celsius e ligando o vácuo enquanto o ultracentrífugo está resfriando. Adicione cinco mililitros do tampão LCM com 0% de glicerol e 0,043% de etanol Beamer capto ao pellet celular e pipete para cima e para baixo para ressuspendê-lo.Certifique-se de desfazer todos os aglomerados, se necessário. Vortexe o tubo para desfazer qualquer pellet de células não dissolvido. Em seguida, para extrair as membranas celulares e virais, adicione 1,5 mililitros.Agite vigorosamente imediatamente com um vortex. Centrifugue por 10 minutos a 2000 RCF a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, haverá duas camadas.A camada superior aquosa contém os nucleocapsídeos virais e proteínas, enquanto a camada inferior de Freon contém as membranas virais e celulares. Usando uma ponteira de pipeta de grande diâmetro, colete a camada superior evitando a interface e transfira para um novo tubo cônico de 50 mililitros. É importante evitar tocar a camada de Freon e transferir esse solvente orgânico para a camada aquosa no novo tubo.Adicione freon e vortex como antes para repetir a extração com Freon após a centrifugação. Colete a camada superior de aproximadamente cinco mililitros e transfira para um novo tubo de ultracentrifugação de polímero. Adicione etanol beamr capto a 0,043% aos dois buffers de LCM de glicerol restantes.Em seguida, para preparar um gradiente no tubo de centrífuga de polímero, use uma pipeta fina para sobrepelar o extrato de Freon com três mililitros de LCM de glicerol a 5%. Em seguida, sobrepelar este com 2,5 mililitros de LCM de glicerol a 45%. Além disso, se necessário, prepare um tubo de equilíbrio equivalente utilizando as mesmas proporções de tampões LCM.Coloque os tubos nos suportes da ultracentrífuga e equilibre-os com diferença máxima de 0,1 grama entre si, adicionando cuidadosamente volumes de 50 a 100 microlitros do tampão LCM com 0% de glicerol à camada superior, de cada vez. Gire as amostras equilibradas por uma hora a 77.000 RCF a quatro graus Celsius durante a ultracentrifugação. Utilize uma pipeta de vidro com ponta em forma de gancho para capturar o DNA flutuante na etapa de precipitação com etanol.Segure ambas as extremidades da pipeta e suspenda a seção central sobre a chama. Quando uma seção do vidro estiver aquecida, puxe suavemente para esticar o vidro. Dobre-a suavemente para criar um gancho com um ângulo agudo inferior a 90 graus e puxe bruscamente para selar a extremidade.Se a ponta do gancho de vidro estiver aberta, segure a ponta sobre as chamas para que o vidro derreta o suficiente e feche. Após a ultracentrifugação, haverá um pellet fino e opaco com um ponto escuro no centro, que contém os nucleocapsídeos virais. Aspire cuidadosamente o líquido do tubo, incluindo as gotas ao longo das laterais, mas evitando o pellet no fundo do tubo.Adicione 0,5 mililitros de TNE à temperatura ambiente. Deixe o pellet repousar por pelo menos 10 minutos para permitir a hidratação do pellet. Se o procedimento não for continuado até o dia seguinte, coloque o pellet ressuspenso a quatro graus Celsius.Usando uma ponta P 200, desagregue o pellet hidratado pipetando para cima e para baixo. Não se preocupe com a quebra por cisalhamento nesta etapa, pois o DNA viral ainda está contido nos capsídeos neste momento. Para romper os capsídeos, adicione ao pellet viral: 4,25 mililitros de TNE, 0,25 mililitros de SDS a 10% e dois miligramas de proteína EK à temperatura ambiente.Balançar suavemente. Para misturar esses reagentes. Deve haver um leve aumento na viscosidade agora que os capsídios foram destruídos; deve-se ter cuidado para evitar a quebra do DNA, utilizando pipetas com ponteiras largas e não vortexando o material viral para extrair as proteínas virais.Transfira a amostra para um tubo com gel de bloqueio de fase e adicione cinco mililitros de fenol-clorofórmio. Inicie imediatamente a inversão para manter uma mistura emulsionada por meio de inversões contínuas ou por pelo menos 10 segundos. Em seguida, centrifugue a emulsão por cinco minutos a 2000 RCF à temperatura ambiente.Após a centrifugação, retire a camada superior e transfira-a para um novo tubo com gel de bloqueio de fase. Repita a extração com fenol-clorofórmio e centrifugue novamente após a segunda extração com fenol-clorofórmio. Colete a camada superior em um tubo de coex de vidro de 30 mililitros e resfrie o tubo a menos 20 graus Celsius por 10 a 15 minutos.Cuidado para não congelar. Adicione 10 mililitros de etanol frio ao dispositivo. Tampe o tubo e inverta para misturar.Observe imediatamente o surgimento de um fantasma de DNA, que consiste num precipitado fino e semelhante a uma corda. Inverta o tubo suavemente para misturar ainda mais e fazer com que os precipitados pegajosos de DNA se agrupem. Por fim, use um gancho de vidro para retirar cuidadosamente os fantasmas de DNA e seque o DNA pressionando-o levemente com um lenço de papel absorvente para remover o excesso de líquido.Em seguida, coloque a ponta do gancho voltada para baixo em um tubo de 1,5 mililitro. Para maximizar o rendimento de DNA, quebre o gancho de vidro dentro do tubo de 1,5 mililitro para que a suspensão de ressus seja liberada aos poucos dos fragmentos de vidro ao longo do tempo. Deixe secar e adicione 0,25 a 0,5 mililitros de TE para dissolver o fantasma de DNA.Deixe a ressuspensão do DNA prosseguir por pelo menos uma hora e armazene o DNA a quatro graus Celsius. O DNA viral foi preparado a partir de nucleocapsídeos conforme descrito neste artigo em vídeo; é mostrado aqui um exemplo representativo de um "fantasma" de DNA bem formado e abundante, consistindo em DNA genômico viral linear precipitado em solução. As fitas se agrupam e exigirão tempo para reidratação assim que colocadas em uma solução Acquia. O DNA viral preparado de cepas de PRV, Becker Bartha e outras quatro cepas adicionais foi submetido à eletroforese por uma hora em gel de agarose 0,5% e corado com brometo de etídio.Cada amostra de PRV utiliza um microlitro de uma preparação de nucleocapsídeo de DNA viral em um volume total de 250 microlitros, à esquerda. Uma escada de DNA do bacteriófago lambda. A digestão com a enzima DNA sty um demonstra o grande tamanho do DNA de lambda não digerido, de 48,5 pares de quilobases, e do DNA genômico do PRV, de aproximadamente 140 pares de quilobases.Em seguida, uma série de diluições com quantidades conhecidas de DNA Lambda demonstra que a concentração das amostras de PRV à direita varia de 50 a 200 nanogramas por microlitro, resultando em um rendimento total de 12 a 50 microgramas por vírus. Amostras de DNA viral preparadas a partir de quatro cepas de PRV foram digeridas durante a noite com BAM H um ou KPN um. As amostras de DNA digeridas com enzimas de restrição foram separadas por eletroforese noturna em gel de agarose 0,8% e coradas com brometo de etídio.As linhas H um incluem oito microgramas de nucleocapsídeo viral, DNA, enquanto as linhas KPN um incluem quatro microgramas de DNA viral. Cada cepa diferente de PRV pode ser distinguida pelos respectivos padrões de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição. Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento profundo, podem ser realizados para obter dados sobre o conteúdo do genoma viral. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de virologia caracterizarem o DNA viral por meio de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição ou R fps, hibridização Southern, clonagem, construção de vírus de DNA recombinante e outras manipulações de vírus herpes e outros tipos de vírus.Não se esqueça de que o trabalho com fon pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar em uma cabine de segurança química, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após a centrifugação, a camada de fon pode mudar rapidamente de um semissólido gelatinoso para um líquido, portanto, cada tubo deve ser avaliado individualmente antes de decidir se o derramamento ou a pipetagem é o melhor método para coletar a camada superior aquosa.

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