Name: Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprenda a isolar DNA viral de alta pureza a partir de nucleocapsídeos de herpesvírus usando ultracentrifugação e extração com fenol-clorofórmio. Este método permite obter DNA concentrado e livre de contaminação.

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Os autores agradecem as contribuições de Greg Smith, Pomeranz Lisa, Matt Lyman, Eldridge Marlies, Staniszewska Halina Goraczniak, e os membros do laboratório Enquist in fine-tuning protocolo isso.

1. Dia primeiro: Infecção viral e Preparação de Buffers <ol><li> Preparar pratos 50-10 (15 cm de diâmetro) de células de cultura de tecidos para a infecção, por exemplo, PK-15 células por vírus pseudo-raiva (PRV) ou células Vero para o vírus herpes simplex (HSV). </li><li> Quando as células são 95 - confluentes 100%, infectá-los em um (MOI) de 10/05. Para fazer isso, inocular cada placa usando o estoque de vírus em um volume total de 4 ml por placa, em seguida, incubar as placas por 1 hora a 37 ° C. Placas de rocha suavemente a cada 15 minutos para garantir que a monocamada de células permanece totalmente revestida pela inóculo do vírus. Enquanto isso, aqueça o meio para a próxima etapa. </li><li> Após uma hora de infecção, aspirado inóculo viral das placas, adicione 15 ml de meio quente, e incubar a 37 ° C por 12-20 horas em uma incubadora umidificada. </li><li> Prepare buffers LCM (ver Tabela 1) e rock durante a noite a 4 ° C para homogeneização da mistura. Prepare TNE para a ressuspensão de DNA viral (ver Tabela 2). </li></ol> 2. Segundo dia, Fase 1: Lise Celular e Ultracentrifugação <ol><li> Confirmar visualmente que a infecção de células causou efeito citopático uniforme (CPE). Permitir a infecção progredindo até que todas as células têm arredondado para cima, mas ainda não decolou no prato. </li><li> Raspe as células infectadas no meio, e combinar as células e médio em 50 ml tubos cônicos. O número de tubos cônicos necessários para esta etapa vai depender do número de pratos utilizados para a infecção no Passo 1.2 acima, por exemplo, um tubo de 50 ml cônica pode ser usado para pellet um máximo de 3 pratos de 15 ml de meio de cada Opcional:. Lave o placas com 10 ml de PBS e combinam com as células e médias empresas. </li><li> Células centrífuga e médio por 10 minutos a 2000 centifugal força relativa (RCF) em temperatura ambiente, em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS. Se o pellet de uma infecção viral foi espalhada em vários tubos cônicos na Etapa 2.2, estes podem ser recombinados em um tubo cônico nesta etapa. Repetir a centrifugação e aspiração Opcional:. Este pellet podem ser armazenadas a -20 ° C e do protocolo continuou em um momento posterior. </li></ol> 3. Segundo dia, Fase 2: Ultracentrifugação Mantenha o pellet celular e buffers LCM no gelo sempre que possível durante as etapas seguintes. <ol><li> Adicionar β-mercaptoetanol para 0% de glicerol - buffer de LCM. Começar a resfriar a ultracentrífuga (para o passo 3.9), definindo-a 4 ° C e ligar o vácuo. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 5 ml de glicerol 0% - tampão LCM até que não é mais clumpy. Se necessário, o tubo de vórtice para quebrar qualquer célula não dissolvido pellet. </li><li> Extrato, adicionando 1,5 ml Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) e vórtex vigorosamente. Imediatamente centrifugar por 10 min a 2000 rcf a uma temperatura de 4 ° C. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande furo (evitando a interface) e transferir para um novo tubo Opcional:. Se o pellet é um sólido gelatinoso, você pode rapidamente despeje a camada superior para um tubo novo. </li><li> Repetir a extracção Freon e centrifugar novamente. </li><li> Coletar a camada superior (~ 5 ml) e transferir para um novo tubo polyallomer ultracentrífuga. Adicionar β-mercaptoetanol para o glicerol dois restantes - buffers LCM. </li><li> Prepare um gradiente no tubo de ensaio polyallomer por underlaying o extrato Freon (camada superior) com 3 ml de glicerol 5% - LCM (camada intermediária), e depois underlaying novamente com 2,5 ml de glicerol 45% - LCM (camada inferior). Use uma pipeta fina para evitar o transbordamento do conteúdo do tubo. </li><li> Se necessário, prepare um tubo de equilíbrio equivalente usando as mesmas proporções de buffers LCM. </li><li> Transferência de tubos em baldes ultracentrífuga. Equilíbrio baldes para dentro de 0,1 g do outro, suavemente adicionando glicerol 0% extra - buffer de LCM para a camada superior (~ 5-10 mL de cada vez). </li><li> Usando uma ultracentrífuga frio com um rotor horizontal balde ou balançando, spin amostras equilibrada durante 1 hora a 77.000 rcf (por exemplo, 25.000 rpm para um rotor SW41Ti) a uma temperatura de 4 ° C. </li><li> Durante ultracentrifugação, fazer um gancho para capturar DNA de vidro flutuante na etapa de precipitação de etanol (4.6). Segure ambas as extremidades de uma pipeta Pasteur de vidro e suspender a parte do meio sobre uma chama. Quando uma seção de vidro é quase derretido, retire com cuidado para esticar o copo, dobre-o suavemente para criar um gancho bem anguladas (&lt;90 graus), e puxe bruscamente para selar o fim. Se a ponta do anzol de vidro está aberto, segure a ponta sobre a chama para que o vidro derrete o suficiente para a fechar. </li><li> Após a ultracentrifugação, você deve ver uma fina opaco pellet com uma mancha escura no meio. Aspirar cuidadosamente o líquido do tubo, incluindo drippings ao longo dos lados, mas evitando a pelota no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 0,5 ml TNE em temperatura ambiente. </li><li> Deixe o pellet sentar-se por pelo menos 10 minutos para permitir a hidratação do sedimento. Optional: O pellet também pode ressuspender em TNE durante a noite, se for mantida a 4 ° C. </li></ol> 4. Terceiro Dia: "Ghost" Precipitação DNA <ol><li> Quebrar o pellet por pipetagem com uma ponteira de pequeno calibre (por exemplo, um p200 ponta da pipeta). Não se preocupe com corte nesta etapa, porque o DNA viral ainda está contida em capsídeos neste momento. Adicionar os reagentes a seguir ao tubo contendo o pellet viral, à temperatura ambiente, para destruir capsídeos: <ul><li> 4,25 ml TNE </li><li> 0,25 ml SDS 10% </li><li> 2 mg de proteinase K </li></ul> Agite levemente para misturar estes reagentes. Deve haver um ligeiro aumento na viscosidade. </li></ol> Cuidado com corte a partir de agora, por exemplo, uso de grande calibre pipetas e não vortex o material viral <ol start="2"><li> Extrato de proteínas virais, adicionando 5 ml de fenol-clorofórmio e imediatamente começar a inverter ou vórtex para manter uma emulsão. Misture por 10 segundos, em seguida, centrifugar a emulsão de 5 minutos a 2000 rcf à temperatura ambiente. Coletar a camada superior com uma ponteira de grande diâmetro, evitando a interface, e transferir para um novo tubo Opcional:. Use fase de bloqueio de gel (PLG) tubos nesta etapa para evitar a contaminação a partir da interface. </li><li> Repita a extração fenol-clorofórmio e centrifugar novamente. </li><li> Após a extração do fenol-clorofórmio segundo, coletar a camada superior em um vidro de 30 ml tubo Corex e descontrair o tubo a -20 ° C por 10-15 minutos, tomando cuidado para que não congela. </li><li> Adicionar 10 ml de etanol gelado, cobrir o tubo (por exemplo, que se estende um pedaço de Parafilm M sobre a parte superior), e inverta para misturar imediatamente. Assistir a um DNA "fantasma" para aparecer, que consiste de um precipitado ropy fina. Inverter o tubo suavemente para misturar mais e fazer com que o DNA sticky precipita a se agrupar. </li><li> Use um gancho de vidro para capturar o fantasma DNA (s). Cuidadosamente blot o DNA para remover o excesso de líquido, em seguida, coloque o gancho (ponta para baixo) em um tubo de 1,5 ml e deixar secar. Adicionar ,25-,5 ml de TE para dissolver o fantasma DNA. Permitir a ressuspensão de DNA para continuar por pelo menos uma hora. DNA armazenar a 4 ° C. Opcional: Para maximizar o rendimento de DNA, romper o gancho de vidro dentro do tubo de 1,5 ml, de modo que a ressuspensão fora os fragmentos de vidro podem continuar ao longo do tempo. </li></ol> 5. Resultados representante Com uma alta suficientemente MOI, as células devem atingir CPE total dentro ~ infecção pós 18 horas (hpi) para as estirpes do tipo selvagem PRV, e ~ hpi 24 para tipo selvagem HSV-1 amostras (Figura 1). Uma vez que o pellet celular infectado é colhido, os passos do protocolo restante pode ser completa em um dia inteiro ou realizadas durante dois dias (Figura 2). Ao preparar anzóis de vidro para capturar o fantasma DNA, é importante fazer o ângulo de gancho ser inferior a 90 graus, para que mais tarde pode caber na base de um tubo de 1,5 ml (Figura 3). Vedação a ponta deste gancho impede a perda de DNA no interior da pipeta. Fantasmas DNA formam durante a etapa de precipitação e vai aparecer como o branco, threads ropy (Figura 4). Estes agregados e ficar uns aos outros e / ou o gancho de vidro usado para capturar o DNA. Assim, o gancho mesmo vidro pode ser usado para juntar vários segmentos de DNA a partir da solução de precipitação. <table border="1"><tbody><tr><td> Escolha coluna com base no volume desejado: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> KCL 1M </td><td> 1,3 ml </td><td> 1,9 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH 7,4) </td><td> 300 ml </td><td> 450 mL </td><td> 600 mL </td><td> 1,2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 </td><td> 10 ml </td><td> 15 mL </td><td> 20 l </td><td> 40 mL </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ul </td><td> 75 mL </td><td> 100 l </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol (adicione imediatamente antes da utilização) </td><td> 4,3 mL </td><td> 6,5 mL </td><td> 8,6 mL </td><td> 17,2 mL </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> Use proporções nas pesquisas de glicerol por cento desejado (0, 5 ou 45%) </td></tr><tr><td> 0% de glicerol </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td><td> Nenhum </td></tr><tr><td> água </td><td> 8,3 ml </td><td> 12,5 ml </td><td> 16,7 ml </td><td> 33,4 ml </td></tr><tr><td> Glicerol 5% </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,8 ml </td><td> 1,0 ml </td><td> 2,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 7,8 ml </td><td> 11,7 ml </td><td> 15,7 ml </td><td> 31,4 ml </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6,8 ml </td><td> 9,0 ml </td><td> 18,0 ml </td></tr><tr><td> água </td><td> 3,8 ml </td><td> 5,7 ml </td><td> 7,7 ml </td><td> 15,4 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Receitas para a preparação de buffers LCM <table border="1"><tbody><tr><td> Para 50 ml </td></tr><tr><td> 5 ml NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2,5 ml 1M Tris, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ml de EDTA 0,5 </td></tr><tr><td> 41,5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação de TNE (0,1 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA) <table border="1"><tbody><tr><td> Para 1 volume L </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g de NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O para 1L </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Preparação de PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, pH 7,0) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Células PK15 (A) antes da infecção, (B) no meio de infecção, e (C) no efeito citopático (CPE), depois de uma multiplicidade de infecção. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visão geral do protocolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Três exemplos representativos de vidro ganchos utilizados para recolher os fantasmas DNA viral. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Exemplo representativo de uma bem-formados e abundantes de DNA "fantasma".

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Partes deste protocolo foram originalmente desenvolvidos para o isolamento do DNA viral no BSL4 condições, mas adapta-se igualmente bem a não-BSL condições. 4 Nós geralmente usam este protocolo para isolar o DNA do PRV alfa-herpesvírus e HSV-1, que têm genomas de DNA fechado em um capsídeo protéico e cercado por um envelope lipídico. 7,8 No entanto, é provável diretamente adaptável a outros vírus DNA de grande porte, incluindo beta-e gama-herpesvírus e adenovírus. Extrações semelhantes são comument...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano) </td><td> Pescador </td><td> T178-4 </td><td> Verifique com sua instituição, para obter orientações sobre o descarte adequado de resíduos contendo Freon, ou ver Mendez et al. de alternativas Freon potencial 9. </td></tr><tr><td> Bloqueio fase de tubos de gel, capacidade de 15ml Pesada </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Opcional </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga tubos Polyallomer </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * Selecione tubos apropriados para o seu próprio ultracentrífuga, que são incluídas apenas como exemplo </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 células </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Células Vero </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de dna viral a partir nucleocapsids

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. 1,2, 3 Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. 4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de 260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections. Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 6 células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 8 unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. 6 Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm). Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Os vírus são parasitas celulares obrigatórios e, portanto, o estudo do seu DNA requer o isolamento do material viral de contaminantes e do DNA da célula hospedeira. ...

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar nucleocapsídeos virais e DNA de alta pureza a partir de células infectadas. Primeiramente, as membranas lipídicas são desnaturadas utilizando uma extração com dupla centrifugação em gradiente de sacarose. Em seguida, a amostra é submetida à ultracentrifugação para formar um pellet dos nucleocapsídeos virais e separá-los dos componentes celulares e virais mais leves.São adicionados detergentes e protease K para liberar o DNA viral dos nucleocapsídeos em pellet. Em seguida, são realizadas extrações duplas com fenol-clorofórmio para remover todas as proteínas remanescentes. Por fim, o DNA viral é precipitado em solução.Por fim, os resultados mostram que o DNA viral altamente concentrado e puro foi isolado dessas células infectadas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que não envolvem extrações livres de enzimas ou ultracentrifugação, é que o DNA viral produzido aqui apresenta níveis muito baixos de contaminação por DNA do hospedeiro, tornando-o ideal para procedimentos posteriores, como PCR e sequenciamento profundo de genomas virais. Utilizamos este método pela primeira vez nos primórdios do trabalho c

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Neste vídeo, descrevemos um procedimento para realizar uma nanoinjeção de um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo em moscas Drosophila machos adultos e, posteriormente, estudamos as respostas antivirais iniciadas devido à infecção. A análise da reação em cadeia da polimerase identifica a regulação positiva de genes específicos nas moscas infectadas que indicam a ativação das vias de resposta imune, incluindo interferência de RNA e sinalização JAK / STAT.

Nanoinjeção viral intratorácica para estudar interações vírus-hospedeiro em moscas adultas

Aqui, é apresentado um protocolo para a criação de um cromossomo artificial bacteriano infeccioso contendo um cDNA de comprimento total do RNA genômico de fita positiva do vírus da encefalite japonesa. Este protocolo pode ser usado para construir um cDNA funcional de outros vírus de RNA de fita positiva, tornando-o uma poderosa ferramenta genômica para estudar a biologia do vírus.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para identificar a planta vírus com genoma de DNA dobro-costa. Utilizamos métodos padrão para extrair o DNA e RNA de folhas contaminadas e realizar o sequenciamento de próxima geração. Ferramentas de Bioinformatic montam sequências em contigs, identificam contigs representando genomas do vírus e atribuir genomas de grupos taxonômicos.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

Aprenda a isolar DNA viral de alta pureza a partir de nucleocapsídeos de herpesvírus usando ultracentrifugação e extração com fenol-clorofórmio. Este método permite obter DNA concentrado e livre de contaminação.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

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