Marcação retrógrada de neurônios motores de Drosophila usando corantes lipofílicos fluorescentes

Comece com um embrião de Drosophila dissecado fixado em uma lâmina de vidro com fita adesiva ao redor.

Os neurônios motores da mosca são marcados com fluorescência para visualização.

Usando um microscópio, visualize o embrião e posicione uma micropipeta preenchida com corante lipofílico fluorescente verde perto do embrião.

Em seguida, mude para o modo de fluorescência e localize a ponta axonal do neurônio motor na junção neuromuscular, onde o neurônio motor se conecta ao músculo.

Mude para o modo de campo claro, entre em contato com a ponta do axônio alvo com a pipeta, libere uma gota de corante e incube.

Devido à sua natureza lipofílica e vizinhança axonal, os corantes entram seletivamente na membrana rica em lipídios do axônio-alvo.

Com o tempo, o corante viaja retrógrado, movendo-se para trás ao longo da bicamada lipídica axonal em direção ao corpo neuronal, rotulando as projeções neuronais.

Remova a fita da lâmina e coloque uma lamínula.

Observe a lâmina sob um microscópio confocal.

O neurônio-alvo retrógrado aparece em fluorescência verde, exibindo morfologia e projeções neuronais detalhadas.

Use uma agulha de vidro sob um microscópio de dissecção para arrastar o embrião da membrana vitelina da fita para o vidro, tomando cuidado para não danificar os tecidos internos do embrião. Em seguida, corte a linha média de um único embrião em sua superfície, de sua extremidade posterior para anterior. Vire os tecidos epiteliais do centro e prenda a borda epidérmica na superfície da lâmina de vidro.

Use uma agulha conectada por tubo com a abertura da ponta de cerca de 300 micrômetros para aspirar ou soprar ar para remover os troncos traqueais longitudinais dorsais, bem como quaisquer vísceras restantes. Use 4% de PFA e PBS para fixar os embriões por 5 minutos em temperatura ambiente em um agitador orbital. Em seguida, lave-os três vezes com PBS.

Manchar os embriões com 1 microlitro de anticorpo anti-peroxidase de rábano conjugado com corante de cianina 3 e 200 microlitros de PBS por uma hora no agitador orbital. E repita as lavagens em PBS. Para encher a micropipeta de injeção, coloque-a no suporte capilar. Em seguida, coloque a lâmina de tinta no palco e use o micromanipulador para posicioná-la sobre a lâmina.

Em seguida, ajuste o estágio para colocar a micropipeta no corante. Colete o corante e a micropipeta ajustando a pressão de injeção entre 200 e 500 hectopascal, o tempo de injeção entre 0,1 e 0,5 segundos e a pressão de compensação para 0 por 5 minutos. Depois que o corante for coletado, remova a lâmina de corante e coloque a amostra no microscópio stage.

Em seguida, aumente a pressão de compensação para uma faixa de 30 a 60 hectopascal e abaixe a micropipeta na amostra. Use a lente objetiva de 10 vezes para localizar o embrião e alinhar a micropipeta com o embrião. Troque a lente objetiva para uma lente de imersão em água 40 vezes e mergulhe a lente no PBS.

Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção. Quando o embrião estiver em foco, mude a posição da micropipeta para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse. Em seguida, use microscopia de campo claro durante a injeção para ver a gota de corante. Solte o corante em um hemissegmento abdominal direito na junção neuromuscular do ACC ou RP3 com DiD ou DiO.

Use o controle manual para liberar o corante e remover a micropipeta. Em seguida, passe para o próximo local de injeção. Incube a amostra por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador orbital antes da imagem. Usando uma pinça fina, remova as fitas da lâmina de vidro.

Para montar a amostra, prepare uma lamínula com uma pequena quantidade de graxa a vácuo nos quatro cantos. Coloque-o cuidadosamente sobre a amostra, certificando-se de evitar bolhas de ar. Empurre a lamínula para baixo para ajustar o espaço da amostra para permitir a distância de trabalho entre a lente objetiva e o slide.

Remova qualquer excesso de PBS com lenços de limpeza. Sele completamente as bordas da lamínula com esmalte. Imagem com ampliação de 10 vezes e 100 vezes com um microscópio confocal e processe as imagens com o software ImageJ.