Imagem da ativação neuronal do hipocampo em seções do cérebro de camundongos

Comece com seções do cérebro de camundongos expondo o hipocampo dorsal, rico em neurônios.

Adicione peróxido de hidrogênio para extinguir a atividade da peroxidase neuronal, seguido de lavagem.

Trate com um tampão de permeabilização e, em seguida, aplique um tampão de bloqueio para bloquear a ligação não específica.

Adicione os anticorpos primários e incube com agitação. Esses anticorpos se ligam a proteínas marcadoras de ativação neuronal.

Lave e aplique anticorpos secundários conjugados com biotina para ligar os anticorpos primários.

Enxágue e introduza um complexo avidina-biotina-peroxidase que se liga à biotina nos conjugados.

Lave novamente e adicione um substrato cromogênico, que é oxidado pela peroxidase para gerar um precipitado marrom. Pare a reação com PBS.

Transfira as seções para uma lâmina revestida de gelatina e desidrate-as usando concentrações crescentes de etanol. Em seguida, limpe as seções em xileno e monte-as.

Coloque a lâmina sob um microscópio de campo claro.

Sob iluminação de luz, regiões não coradas transmitem luz e parecem brilhantes, enquanto neurônios corados absorvem e refletem a luz e parecem mais escuros.

A área mais escura distinta indica ativação neuronal dentro do hipocampo.

Transfira de três a cinco seções dorsais do hipocampo para cada camundongo nos poços de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de PBS 0,1 molar para cada poço. Lave as seções contidas em cada poço com 500 microlitros de PBS 0,1 molar. Realize todas as lavagens e incubações à temperatura ambiente com agitação suave, salvo indicação em contrário. Sob uma capela de exaustão, incubar as seções em 40% de metanol, 1% de peróxido de hidrogênio em 0,1 molar PBS por 20 minutos para extinguir a atividade da peroxidase endógena.

Após mais três lavagens em PBS 0,1 molar, permeabilize as seções incubando-as em 500 microlitros de Triton X-100 a 0,2% por cinco minutos. Enquanto as seções estão incubando, prepare um buffer de bloqueio suficiente para todo o experimento. Em seguida, remova a solução de permeabilização e adicione 100 microlitros do tampão de bloqueio a cada poço. Incube as seções por uma hora.

Em seguida, remova o tampão de bloqueio e cubra as seções com anticorpo primário de quinase regulada extracelular fosforilada, diluído de 1 a 500 em tampão de bloqueio. Incube as seções durante a noite a 4 graus Celsius com agitação suave. No dia seguinte, após lavar as seções três vezes em PBS 0,1 molar por 5 minutos cada, incubar as seções com um anticorpo secundário conjugado com biotina diluído 1 a 250 tampão bloqueador por uma hora em temperatura ambiente.

Durante a incubação, prepare o reagente ABC pelo menos 30 minutos antes da utilização, a fim de dar tempo suficiente à formação do complexo avidina e biotina. Depois de lavar as seções mais três vezes com PBS 0,1 molar, adicione o reagente ABC e deixe-o incubar com a amostra por 45 minutos. Durante a próxima série de três lavagens em PBS, prepare a solução de trabalho no exaustor de acordo com as especificações do fabricante. Alíquota da solução de trabalho dab na placa.

Em seguida, transfira as seções para os poços que contêm a solução de trabalho DAB e gire lentamente a placa para permitir a exposição máxima das seções à solução. Monitore a reação DAB em um microscópio até que o sinal adequado se desenvolva em cerca de dois a cinco minutos. Pare a reação na intensidade de cor desejada lavando o tecido em PBS 0,1 molar. Após mais três lavagens em PBS, monte as seções em lâminas revestidas de gelatina e seque-as em temperatura ambiente por pelo menos três a quatro horas.

Depois de secas ao ar, transfira as corrediças na hotte e desidrate as secções colocando-as sequencialmente em soluções de etanol graduadas durante dois minutos cada. Em seguida, limpe as lâminas em xilenos 100% por cinco minutos. Cubra as corrediças usando o meio de montagem e deixe-as secar na hotte durante a noite.

Transfira as lâminas para um microscópio de campo claro equipado com uma câmera em lente objetiva de 20x. Adquira várias imagens de campo claro de cada seção com ampliação de 200x, cobrindo o hipocampo dorsal. Imagem de três a cinco seções de cada animal.