Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:40 min. • April 28th, 2025
Prenda uma fatia organotípica de hipocampo de camundongo em uma câmara experimental.
A fatia contém neurônios transduzidos e astrócitos expressando um sensor de ATP com proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras.
Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência platina e perfunda-a com ACSF oxigenado.
Permite que a fatia se adapte às condições de buffer.
Usando a luz de transmissão, focalize a fatia e identifique a área de interesse.
Mude para o modo de fluorescência e excite a proteína fluorescente doadora para iniciar a emissão de fluorescência.
Após a ligação do ATP, o sensor sofre mudanças conformacionais, permitindo a transferência de energia baseada em fluorescência do doador para o aceitador, que emite fluorescência em um comprimento de onda mais longo.
Use um espelho dicróico e filtros passa-banda para isolar e separar as emissões de doadores e aceitadores.
Selecione uma região sem fluorescência para subtração de fundo. Em seguida, identifique as células-alvo e registre sua fluorescência ao longo do tempo.
Calcule a razão FRET para monitorar os níveis de ATP intracelular em tempo real.
Prepare o ACSF experimental e obtenha um pH de 7,4 borbulhando-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono através de um tubo inserido conectado ao suprimento de carbogênio por pelo menos 30 minutos. Mantenha a solução salina borbulhando durante todo o experimento. Em seguida, ligue a fonte de luz fluorescente do monocromador.
Transferir a cultura organotípica para a câmara experimental. Coloque uma grade em cima da cultura de fatias organotípicas com a moldura para baixo, sem tocar na cultura, e os fios para cima, tocando a membrana. Coloque a câmara no microscópio stage e conecte-a ao sistema de perfusão.
Ligue a bomba peristáltica a uma vazão de 1,5 a 2,5 mililitros por minuto. Certifique-se de que não haja vazamento do sistema de perfusão. Focalize a fatia cultivada e identifique a área onde as experiências devem ser realizadas.
Antes de iniciar os experimentos de imagem, espere pelo menos 15 minutos para permitir que as fatias se adaptem às condições salinas. Em seguida, ligue a câmera e o software de imagem. Excite a proteína fluorescente do doador a 435 nanômetros. Defina o tempo de exposição entre 40 e 90 milissegundos.
Em seguida, insira o espelho dicróico e os filtros na unidade divisora de feixe. Divida a emissão de fluorescência em 500 nanômetros com um divisor de imagem de emissão e empregue filtros passa-banda em 482 mais ou menos 16 e 542 mais ou menos 13,5 nanômetros para isolar ainda mais a fluorescência do doador e do aceitador.
Selecione uma região de interesse aparentemente desprovida de fluorescência celular para subtração de fundo. Circule estruturas únicas de tecido marcado na imagem na tela para criar ROIs. Defina a frequência de aquisição de imagem no tempo total de gravação. Para experimentos com duração superior a 30 minutos, recomenda-se uma frequência de aquisição de 0,2 a 0,5 Hertz para evitar fototoxicidade. Em seguida, inicie a gravação.