Imagem da dinâmica de ATP intracelular usando sensores baseados em FRET em uma fatia de hipocampo de camundongo organotípica

Prenda uma fatia organotípica de hipocampo de camundongo em uma câmara experimental.

A fatia contém neurônios transduzidos e astrócitos expressando um sensor de ATP com proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras.

Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência platina e perfunda-a com ACSF oxigenado.

Permite que a fatia se adapte às condições de buffer.

Usando a luz de transmissão, focalize a fatia e identifique a área de interesse.

Mude para o modo de fluorescência e excite a proteína fluorescente doadora para iniciar a emissão de fluorescência.

Após a ligação do ATP, o sensor sofre mudanças conformacionais, permitindo a transferência de energia baseada em fluorescência do doador para o aceitador, que emite fluorescência em um comprimento de onda mais longo.

Use um espelho dicróico e filtros passa-banda para isolar e separar as emissões de doadores e aceitadores.

Selecione uma região sem fluorescência para subtração de fundo. Em seguida, identifique as células-alvo e registre sua fluorescência ao longo do tempo.

Calcule a razão FRET para monitorar os níveis de ATP intracelular em tempo real.

Prepare o ACSF experimental e obtenha um pH de 7,4 borbulhando-o com 95% de oxigênio e 5% d