Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Pegue um camundongo transgênico anestesiado com a cabeça presa em um ângulo em um suporte para imagens in vivo da retina do camundongo.

A retina contém células ganglionares da retina, ou RGCs, expressando uma proteína marcada com fluoróforo.

Aplique lubrificante para os olhos e monte uma lamínula sobre o olho.

Sob um microscópio, ilumine uniformemente a retina para excitar as proteínas fluorescentes nos RGCs.

Usando a fluorescência emitida, obtenha uma visão de campo amplo dos RGCs do plano focal e dos RGCs fora de foco.

Mude para o modo de imagem de dois fótons, focando a luz infravermelha próxima de baixa energia na camada RGC.

No ponto focal, a energia combinada de dois fótons excita o fluoróforo, que então libera energia como fluorescência.

Como a excitação está confinada a um único ponto, a fluorescência de outros planos focais é minimizada.

Capture imagens em vários planos focais ao longo do eixo z para criar imagens de toda a camada RGC.

Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos do mouse. Gire o braço principal do suporte da cabeça até que a pupila de um olho esteja orientada alinhada com o caminho da luz e coloque uma lamínula número 1.5 no porta-filtro compacto. Depois de prender o suporte ao microscópio stage, abaixe a lamínula até que ela entre em contato com o lubrificante i-gel sem tocar na córnea. E ajuste o stage na dimensão xy e a posição z objetiva até que a luz de excitação de campo amplo cubra totalmente a córnea.

Use a ocular para continuar a ajustar a posição z, até que as células ou estruturas fluorescentes da retina entrem em foco, aumentando o iluminador de epifluorescência conforme necessário para resolver células ou estruturas individuais de interesse. Ajuste o alinhamento da retina com o caminho da luz de imagem. Ajuste o ângulo da cabeça até que ocorra apenas a expansão ou contração da luz desfocada ao alterar o plano focal, minimizando as distorções xy.

Em seguida, desligue o iluminador de epifluorescência e feche o obturador do iluminador. Para imagens de dois fótons, siga todos os protocolos institucionais de segurança a laser. Desligue e cubra toda a luz ambiente e mude o caminho da luz de excitação para o laser e o caminho da luz de emissão para os PMTs.

No software de aquisição de imagem, defina o tamanho do quadro para 512 por 512 e a média do quadro para 3. Defina o passo z para começar no topo da pilha e progredir para baixo, minimizando a ativação do laser de dois fótons dos fotorreceptores. Ligue e habilite os PMTs e ajuste a tensão para 680 volts.

Ative os obturadores de imagem e emissão. Inicie uma visualização de imagem ao vivo do tecido alvo a partir de uma potência de laser de 1% e ajuste automaticamente o brilho da tela para visualizar as células ou estruturas de interesse. Se o tecido alvo estiver escuro ou pouco claro, aumente a porcentagem de potência do laser até que as estruturas se tornem visíveis sem ultrapassar 45 miliwatts.

Manobre o estágio do microscópio na direção xy para centralizar em uma área de imagem desejada e navegue até o plano z, com as estruturas de interesse em foco. Para um experimento de lapso de tempo crônico, abra uma imagem obtida anteriormente para usar como referência para as células de interesse, tomando cuidado para que o ângulo da imagem na imagem atual seja semelhante ao das imagens anteriores. Em seguida, navegue até os planos z superior e inferior de interesse para definir os limites z da pilha de imagens e adquirir a imagem.