Imagem de fluorescência da dinâmica neuroimune usando um implante de crânio

Comece com um camundongo transgênico anestesiado com uma janela circular de imagem de vidro e uma placa de cabeça implantada em seu crânio.

As células e neurônios microgliais ou imunológicos são marcados com proteínas fluorescentes.

Em seguida, prenda o mouse no estágio do microscópio de dois fótons.

Em seguida, injete um corante fluorescente intraperitonealmente para manchar os vasos sanguíneos de vermelho.

Limpe a janela de imagem de vidro, aplique uma gota salina e abaixe a objetiva do microscópio.

Em seguida, defina a luz do laser para capturar uma imagem dos vasos sanguíneos. Registre o padrão de ramificação e as coordenadas para localizar e criar imagens da mesma região posteriormente.

Agora, defina o laser para excitar as proteínas fluorescentes, fazendo com que a microglia e os neurônios fiquem fluorescentes.

Usando o padrão de ramificação registrado, localize a mesma região e capture regularmente imagens de células.

A rede vascular e os neurônios permanecem estáveis, enquanto a posição microglial muda ao longo do tempo reflete a dinâmica imunológica em resposta à atividade neuronal.

Faça uma abertura circular de aproximadamente 4 milímetros no crânio usando uma broca odontológica. Durante a perfuração, umedeça regularmente o crânio com soro fisiológico estéril e cotonetes para resfriar o cérebro. Limpe os detritos ósseos e amoleça o osso do crânio.

Quando terminar, remova cuidadosamente esta parte do crânio com uma pinça pontiaguda. Depois que o crânio for removido, coloque cuidadosamente uma pequena lamínula umedecida com solução salina na craniotomia. Seque o excesso de solução salina usando um lenço estéril. Usando um aplicador pontiagudo, aplique cola de cianoacrilato ao redor da janela e deixe-a se prender ao cérebro e ao crânio.

Aplique a cola de primer no resto do crânio e catalise com uma luz de polimerização por 20 a 40 segundos. Crie um poço ao redor da janela com a cola final e cure com uma luz de polimerização por 20 a 40 segundos. Cole uma pequena placa de cabeça no crânio no hemisfério contralateral da craniotomia com a cola primer e, em seguida, com a cola final, cure ambos por 20 a 40 segundos.

Depois que o camundongo acordar, injete uma dose subcutânea de buprenorfina SR como analgesia pós-operatória, que será suficiente para 72 horas. Forneça ao rato alimentos macios extras para facilitar uma recuperação saudável. A imagem pode ser realizada até duas semanas após a cirurgia de implantação. Use parafusos para montar a placa da cabeça no microscópio de dois fótons platina, que deve ser mantido a 35 graus Celsius com uma placa de aquecimento.

Injete no camundongo por via subcutânea 100 microlitros de corante de vasos sanguíneos, como a rodamina B. Limpe suavemente a superfície da janela craniana com um cotonete embebido em etanol a 70%. Coloque algumas gotas de água ou soro fisiológico na janela e abaixe a lente objetiva na solução. Certifique-se de que o laser esteja desligado enquanto a objetiva está abaixando.

Desenhe à mão um mapa do curso para denotar os principais pontos de referência dos vasos sanguíneos, enquanto olha pela ocular. Use este desenho para identificar as regiões específicas durante a aquisição de imagens de dois fótons. Colete imagens de células e vasos fluorescentes usando imagens de dois fótons. Veja o manuscrito do texto para parâmetros de imagem. Faça anotações cuidadosas com coordenadas apropriadas para garantir que as regiões precisas possam ser revisitadas para imagens subsequentes.

Colete vários campos de visão nesta sessão inicial de imagens.