Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:48 min. • May 29th, 2025
Comece com uma configuração de microscópio de fluorescência contendo um diafragma imobilizado com nervos frênicos de um camundongo transgênico.
A junção neuromuscular do diafragma consiste em um neurônio motor, uma fibra muscular e células de Schwann contendo receptores de acetilcolina e canais de cálcio.
Essas células têm receptores de acetilcolina marcados com fluorescência e expressam indicadores de cálcio intracelular.
Um divisor de imagem conectado à configuração permite a visualização simultânea de ambos os sinais fluorescentes.
O nervo frênico é posicionado em um eletrodo de sucção para fornecer estímulo elétrico.
Sob o microscópio de fluorescência, visualize os receptores de acetilcolina para identificar uma junção neuromuscular.
Para definir uma fluorescência basal máxima, adicione uma solução de cloreto de potássio para despolarizar a membrana celular temporariamente. Isso desencadeia o influxo intracelular de cálcio, causando um aumento na fluorescência dos indicadores.
Ajuste as configurações de brilho para evitar a saturação excessiva do sinal de fluorescência.
Após a repolarização, aplique estímulos elétricos para desencadear o influxo de cálcio na célula e registre a mudança na fluorescência intracelular em uma alta taxa de quadros.
Com ampliação de 20 vezes, localize a banda da placa terminal no centro do músculo procurando por junções neuromusculares de alfa-bungarotoxina marcadas com fluorescência sob excitação de luz verde amarela. Mude para a excitação da luz azul para obter imagens das respostas de cálcio nos músculos, neurônios motores ou células de Schwann. Neste exemplo, GCaMP 3 é expresso em células musculares.
Se desejar, configure o divisor de imagem com filtros passa-banda e filtro dicróico de borda única para a imagem de comprimento de onda duplo. Realize experimentos com a barra de brilho na barra da tabela de pesquisa, definida para 110% do nível no qual o indicador de cálcio geneticamente codificado que expressa o tecido exibe saturação com ampliação de 20 vezes, sem binning em resposta ao cloreto de potássio.
Grave a 20 quadros por segundo para não perder nenhum evento rápido. Estimule com 1 a 45 segundos de 20 a 40 hertz de estimulação nervosa, fornecendo um trem de impulsos usando um eletrodo de sucção. E coletar respostas dinâmicas de cálcio fluorescente em um subtipo de célula, juntamente com o sinal de junção neuromuscular de alfa-bungarotoxina marcada com fluorescência estática
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