Imagem de espalhamento Raman estimulado em duas cores do tecido cerebral de camundongos

Pegue uma fatia de cérebro de camundongo dentro de uma câmara em uma lâmina e coloque-a sob um microscópio com um sistema de imagem de espalhamento Raman estimulado, ou SRS.

Concentre dois feixes de laser sincronizados, conhecidos como bomba e feixes de Stokes, no tecido.

A diferença de energia entre esses feixes corresponde à frequência vibracional de moléculas específicas, induzindo vibrações moleculares.

Excita os lipídios e proteínas teciduais, tendo vibrações moleculares únicas, usando pares de frequência distintos dos feixes sincronizados.

A excitação facilita a transferência de energia entre os feixes, reduzindo a intensidade do feixe da bomba enquanto aumenta a intensidade do feixe de Stokes.

A mudança de intensidade relativa é detectada como um sinal SRS que ajuda a identificar as moléculas.

Um fotodetector coleta os sinais SRS combinados da amostra.

Atribua os sinais lipídicos e proteicos a cores separadas, criando uma imagem bicolor, para identificar as proteínas e lipídios no tecido cerebral.

Coloque um amostrador de feixe no caminho do feixe de Stokes para pegar 10% do feixe. E envie-o para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 8 megahertz. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-a com um filtro passa-banda para obter a onda senoidal de 20 megahertz. Em seguida, use um atenuador de RF para ajustar a tensão de pico a pico de entrada/saída para aproximadamente 500 milivolts. Envie a saída resultante para um deslocador de fase, o que permite o ajuste fino da fase de RF com uma fonte de tensão.

Envie esta saída para um amplificador de potência de RF e conecte a saída do amplificador ao EOM. Depois de desbloquear o feixe de stokes, otimize a profundidade de modulação do primeiro EOM colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste o volume EOMtage e a placa de quarto de onda até que a profundidade de modulação pareça satisfatória. Coloque um fotodiodo após o espelho dicróico para detectar o feixe de laser. Bloqueie o feixe de stokes primeiro. Em seguida, aumente o zoom em um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal desse pico com o osciloscópio.

Agora, bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie o feixe de stokes. Converta o estágio de atraso para corresponder temporariamente as posições de pico no osciloscópio à posição marcada na etapa anterior, calculando a distância de atraso necessária para combinar os dois feixes, seguido pelo alongamento do caminho do feixe mais rápido ou encurtando o caminho do feixe do feixe mais lento.

Em seguida, prepare uma amostra de lâmina de microscópio com DMSO e fita dupla face como espaçador para segurar a amostra entre a lâmina e uma lamínula. Coloque a amostra no microscópio com o lado da lamínula voltado para a objetiva do microscópio e observe a amostra da ocular sob iluminação de campo claro. Encontre o foco da amostra na camada superior e inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro. Em seguida, mova o foco para ficar entre as duas camadas da fita.

Em seguida, defina a entrada/saída do feixe ajustável para 798 nanômetros. Com base na taxa de transferência óptica do condensador, ajuste a potência óptica para aproximadamente 40 miliwatts cada para a bomba e alimenta os feixes no foco da objetiva. Em seguida, abra a imagem de digitalização no Matlab e clique no botão Foco para iniciar a digitalização. Ajuste o espelho de direção antes do scanner galvo para centralizar o sinal DC no visor do canal 1.

Mova o atraso motorizado stage e observe atentamente o bloqueio na saída mostrado no visor do canal dois. Por fim, ajuste o atraso de tempo para maximizar a intensidade do sinal CA. Ajuste o espelho dicróico para centralizar o sinal SRS no canal CA. Em seguida, ajuste a fase do bloqueio no amplificador para maximizar o sinal.

Depois de montar a amostra, deslize para o microscópio e ajuste a potência de ambos os feixes para aproximadamente 40 miliwatts cada no foco da amostra, conforme demonstrado anteriormente, imagem de varredura aberta do Matlab. Em seguida, encontre o sinal SRS máximo varrendo o estágio de atraso correspondente ao pico Raman de 2913 centímetros inversos do DMSO.

Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico Raman de 2913 centímetros inversos do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro. Use a função de medida para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada. Para calibração do eixo de frequência, salve uma varredura hiperespectral com o intervalo de estágio de atraso cobrindo os picos Raman de 2.913 e 2.994 centímetros inversos do DMSO.

Em seguida, salve as posições do palco correspondentes ao conjunto de dados hiperespectrais. Realize regressão linear para as posições do palco e deslocamentos Raman em 2.913 e 2.994 centímetros inversos. Usando a equação de regressão linear, converta as posições de atraso para as frequências Raman correspondentes. Para calibração da resolução espectral, estime a posição do estágio com base na posição anterior com o aumento do comprimento do caminho óptico devido à inserção de hastes. Realinhe a sobreposição espacial do feixe devido ao ligeiro desvio do feixe quando as hastes de vidro são adicionadas.

Instale um divisor de feixe polarizador, uma placa de quarto de onda e um segundo EOM no caminho do feixe de stokes após o primeiro EOM. Desconecte a entrada de sinal para o segundo EOM. Em seguida, conecte a entrada de sinal ao primeiro EOM e ligue-o. Module o feixe de stokes em megahertz enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do primeiro EOM para garantir que o feixe esteja centralizado através do cristal EOM. Prepare uma amostra de fatia de tecido com fita dupla face, lâmina de microscópio e lamínula.

Coloque a amostra no microscópio com o lado da lamínula voltado para a objetiva do microscópio. Para imagens SRS de modo Epi, instale uma placa de meia onda antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que entra no microscópio. Coloque um divisor de feixe polarizador acima da objetiva para permitir que o feixe refletido de fundo despolarizado alcance o detector.

Em seguida, use uma lente acromática de 75 e uma lente asférica milimétrica para retransmitir os fótons retroespalhados da abertura traseira da objetiva para o fotodetector. Monte o detector para coletar a luz retroespalhada direcionada pelo divisor de feixe polarizador. Em seguida, instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.