Microscopia de dois fótons de astrócitos e neurônios excitatórios em um tecido hipocampal de camundongo limpo

Comece com um tecido hipocampal de camundongo limpo tornado opticamente transparente pela remoção de lipídios. O tecido é incorporado em uma malha de hidrogel para estabilizar as biomoléculas e preservar as estruturas celulares.

O tecido contém astrócitos que expressam proteína fluorescente vermelha e neurônios excitatórios que expressam proteína nuclear verde, permitindo uma visualização distinta.

Coloque o tecido em uma lâmina e crie uma câmara usando cola quente, deixando uma pequena lacuna.

Aplique uma solução de correspondência de índice de refração para hidratar o tecido e evitar bolhas, depois sele com uma lamínula.

Encha a câmara com uma solução de correspondência de índice de refração para reduzir a dispersão de luz e fechar a lacuna.

Visualize o tecido usando um microscópio de dois fótons.

A luz infravermelha próxima excita as proteínas fluorescentes vermelhas e verdes no plano focal, permitindo imagens de alta resolução com fotodano mínimo. As emissões de fluorescência são detectadas separadamente, revelando claramente a proximidade espacial entre os astrócitos e os núcleos dos neurônios excitatórios.

Primeiro, coloque a amostra no meio do slide. Usando cola quente, crie paredes nas bordas da lâmina, quase tão altas quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna em um dos cantos. À medida que a camada de cola quente se aproxima da altura da fatia de cérebro, aplique uma a duas gotas da solução correspondente ao índice de refração na amostra para umedecer a superfície superior e evitar a formação de bolhas.

Enquanto a cola quente ainda estiver líquida, feche a parte superior com uma lamínula, colocando-a o mais uniformemente possível. Em seguida, encha a câmara com a solução de correspondência do índice de refração. Feche a lacuna com cola quente. Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas da lâmina, corte as bordas extensíveis. Se uma objetiva de imersão em óleo for usada para geração de imagens, adicione mais dois a três milímetros de cola nas paredes acima da lamínula para reter a solução de imersão. Após este protocolo, o tecido cerebral será limpo.