Quantificando neurônios recém-gerados no tecido cerebral de ratos usando a técnica do fracionador óptico

Pegue fatias de cérebro de hipocampo de um rato injetado com bromodeoxiuridina, ou BrdU, um análogo de nucleosídeo da timidina.

O BrdU se integra ao DNA durante a divisão celular, rotulando neurônios recém-gerados dentro do giro denteado, uma região para neurogênese.

Incubar com um agente oxidante para inativar as enzimas peroxidase endógenas.

Trate com ácido para desnaturar o DNA e expor o BrdU, depois neutralize o ácido.

Incubar com um detergente para permeabilizar as membranas celulares e uma solução de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incubar com anticorpos primários direcionados ao BrdU, seguidos por anticorpos secundários marcados com peroxidase específicos para os anticorpos primários.

Introduza um substrato cromogênico e um agente oxidante, permitindo que a peroxidase converta o substrato em um resíduo colorido.

Monte o tecido e contra-core com um corante de ligação ao ácido nucleico.

Desidrate o tecido e trate-o para aumentar a transparência.

Sob um microscópio, identifique o giro denteado.

Usando a técnica do fracionador óptico, analise vários planos ao longo da espessura do tecido para quantificar os neurônios marcados com BrdU.

Quando estiver pronto para começar, a imunocoloração permite que as seções atinjam a temperatura ambiente. Em seguida, use um pincel para transferir cada quinta seção de uma série de seções do hipocampo para redes de coloração de 25 poços colocadas em placas de Petri cheias de PBS. Deve haver de 8 a 12 seções por hipocampo para coloração. Transfira as redes de coloração, contendo as seções, para pratos de vidro correspondentes, contendo PBS, e lave as seções duas vezes por 10 minutos em PBS.

Em seguida, incube em peróxido de hidrogênio a 3% por 20 minutos. Após a lavagem, passe as seções por três soluções de ácido clorídrico. Em seguida, neutralize em tetraborato de sódio 0,1 molar em temperatura ambiente por 20 minutos.

Após três incubações de 10 minutos em trocas de tampão de lavagem, transferir as secções para a solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, incubar as seções em camundongo anti-BrdU, diluído de 1 a 100 em solução de bloqueio por 48 horas a 4 graus Celsius.

Após a incubação do anticorpo primário, lave três vezes por 10 minutos cada em tampão de lavagem e, em seguida, incube por 48 horas em peroxidase de raiz-forte, diluída de 1 a 10 em tampão de lavagem. 48 horas depois, transfira as seções para PBS por 10 minutos e repita por um total de cinco lavagens. Após a lavagem, transfira as secções para a solução DAB durante sete minutos. Em seguida, transfira para uma solução DAB contendo peróxido de hidrogênio a 0,02% por 10 minutos.

Após uma série de lavagens, monte as seções em ordem numérica nas lâminas do microscópio. Deixe secar por aproximadamente 30 minutos. Em seguida, seque as amostras ao ar, colocando-as em um rack de lâminas. Em seguida, reidratar as amostras durante 10 minutos numa placa de coloração de lâminas contendo água destilada.

Em seguida, transfira as lâminas para 0,02% de cristal violeta em água destilada por 15 minutos. Depois de repetir a mancha violeta cristalina, reidratar as seções através de uma série de etanol. Em seguida, limpe as seções de xileno duas vezes por 15 minutos de cada vez. Por fim, adicione meio de montagem de secagem rápida e aplique lamínula nas lâminas.

Após 24 horas, as lâminas podem ser usadas para microscopia. Comece verificando a espessura do tecido colocando primeiro as lâminas no estágio motorizado do microscópio e, em seguida, abrindo o software de estereologia. Delineie a área de interesse usando uma objetiva de baixa ampliação antes de mudar para uma objetiva de imersão em óleo de 100x.

Em seguida, escolha um ponto específico no quadro de contabilidade, por exemplo, uma área adjacente a um canto, e localize a parte superior da seção movendo-se ao longo do plano focal até que algum recurso da seção apareça em foco. Registre essa posição z como 0. Em seguida, mova o plano focal para baixo através do tecido até que o último nível z do tecido esteja em foco e, em seguida, marque essa posição. A espessura local do tecido é definida de 0 a este ponto final e pode ser lida no eixo z.

Registre a espessura do tecido. A espessura do tecido é medida em vários locais dentro da região de interesse. A altura do dissector e das zonas de proteção, o tamanho da contagem, o quadro, o comprimento do passo e a ampliação final são determinados em um estudo piloto. Agora, você pode começar a contar os neurônios BrdU-positivos, geralmente em uma ampliação final de 2.000 a 3.000x, usando uma objetiva de óleo de 60x ou 100x de óleo e uma abertura numérica alta.

Identifique os neurônios BrdU positivos em cada quadro de contagem, mas não conte aqueles que tocam a linha vermelha de exclusão. Conte os neurônios BrdU positivos que tocam a linha de inclusão verde e aqueles que estão dentro do limite do quadro de contagem. Conte apenas os neurônios BrdU positivos quando a característica de interesse for claramente reconhecida dentro da altura do dissector. Os neurônios semivisíveis mostrados aqui não são contados.