Imagens ao vivo do olho de pupa de Drosophila usando microscopia de fluorescência

Comece com uma pupa de Drosophila transgênica com o olho exposto.

Coloque a pupa em uma conta de gelatina dentro de uma moldura de papel hidratado, cercada por um anel de gelatina.

O olho da pupa contém proteínas de junção marcadas com GFP que destacam os limites celulares no neuroepitélio do olho em desenvolvimento.

Pressione suavemente uma lamínula na região do olho da pupa.

Sob um microscópio fluorescente, as junções marcadas com GFP fluorescem, exibindo a organização do neuroepitélio.

Tire imagens em intervalos regulares em diferentes profundidades e processe as imagens para melhorar o contraste e minimizar o ruído de fundo.

Alinhe essas imagens com intervalos de tempo crescentes para rastrear o neuroepitélio em desenvolvimento.

Inicialmente, as células primárias formam limites em torno de aglomerados de células fotorreceptoras, enquanto as células interomatidiais ou CIs se organizam em uma única camada.

Posteriormente, os CIs se diferenciam em células secundárias e terciárias próximas aos fotorreceptores.

Finalmente, o excesso de CIs é removido por meio da morte celular programada, formando uma rede hexagonal que estrutura o olho organizado.

Usando uma pinça, levante e remova cuidadosamente o opérculo para expor a cabeça da pupa. Em seguida, rasgue ao longo da lateral da caixa de pupa para expor a área ao redor de um olho. Remova suavemente a pupa da fita adesiva.

Construa uma pequena moldura de 15 milímetros quadrados com papel mata-borrão e faça um furo de 5 milímetros no meio. Mergulhe a estrutura em água destilada e coloque-a no centro de uma lâmina de microscópio. Com uma seringa de 30 cc, esprema um anel uniforme de vaselina para envolver a moldura do papel mata-borrão.

Em seguida, adicione uma pequena gota de vaselina diretamente na lâmina. Disponha cuidadosamente a pupa de lado e apoie-a com a conta de vaselina. Coloque uma lamínula no topo do anel de vaselina de modo que ele entre em contato com o epitélio acima do olho. Comprima suavemente a preparação para selar a lamínula contra a vaselina e gerar uma superfície de contato pequena e plana entre a região do olho da pupila e a lamínula.

Imagem da preparação da pupa usando um microscópio fluorescente. Capturar cortes seriados através do domínio apical do neuroepitélio ocular na região da junção aderente a cada sete minutos. Use o software de deconvolução apropriado para reduzir o fundo e melhorar o contraste das imagens da seção serial.

Para cada arquivo de pilha z no software LAS AF, navegue até o painel Ferramentas, selecione Deconvolução 3D e clique em Aplicar. Gere uma projeção máxima, ou imagem MP, para cada arquivo de pilha descomplicado. Alinhe cada imagem MP para destacar comportamentos celulares individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo, usando os algoritmos integrados no Photoshop CS5.

Na guia Arquivo do menu Principal, abra Scripts e selecione Carregar arquivos na pilha. Em seguida, importe os arquivos de imagem MP para o painel Carregar camadas. Certifique-se de que a opção Tentativa de alinhar automaticamente as imagens de origem não esteja selecionada, caso contrário, os dados da imagem podem ficar distorcidos. Depois que todos os arquivos MP forem carregados no painel de camadas, verifique se todas as imagens estão em ordem cronológica e se o ponto de tempo mais antigo está no topo da pilha de camadas. Arraste e solte-os até que sejam ordenados corretamente, se necessário.

Em seguida, selecione Alinhar camadas automaticamente. Escolha Reposicionar e clique em OK.