Imagem longitudinal de dois fótons de neurônios marcados com fluorescência em um hipocampo de camundongo vivo

Pegue um camundongo transgênico anestesiado expressando proteínas fluorescentes em neurônios piramidais esparsos.

O camundongo é implantado com uma cânula de imagem sobre o hipocampo dorsal.

Posicione o mouse sob o microscópio de dois fótons em uma almofada de aquecimento, prendendo a placa da cabeça da cânula ao suporte para imobilizar sua cabeça.

Aplique pomada para evitar o ressecamento da córnea.

Limpe a cânula com água deionizada e inspecione-a sob uma objetiva de baixa ampliação para verificar se há detritos, danos ou problemas de fluorescência.

Alinhe a cânula de imagem com o eixo óptico do microscópio para obter imagens precisas.

Em seguida, mude para uma objetiva de alta resolução de imersão em água.

Encha a cânula com água deionizada, garantindo que não haja bolhas de ar para evitar distorção da imagem.

Realize imagens longitudinais de dois fótons usando luz infravermelha para excitar seletivamente fluoróforos no plano focal, permitindo imagens de tecidos profundos.

A cânula implantada facilita o acesso repetido ao hipocampo dorsal para rastrear as alterações dendríticas ao longo do tempo.

Posicione o mouse sob o microscópio sobre o tapete de aquecimento e prenda a placa da cabeça ao suporte. Aplique pomada para os olhos nos olhos do animal. Em seguida, limpe a cânula de imagem usando uma seringa e uma agulha fina para colocar água deionizada na cânula, seguida de remoção com uma bomba de vácuo.

Use objetivas de baixa ampliação e longa distância de trabalho para verificar visualmente a cânula quanto a água residual, sujeira, integridade e presença de fluorescência. Em seguida, alinhe a cânula ao eixo óptico ajustando os ângulos dos braços do suporte da cabeça.

Mude para uma objetiva de 25x com uma abertura numérica de 1,0 e uma distância de trabalho de 4 milímetros. Em seguida, adicione água deionizada suficiente à cânula para enchê-la e manter o excesso de água em cima da cânula. Finalmente, use a excitação de dois fótons e a imagem dos sinais fluorescentes.