Monitoramento da recuperação de células interneuromast abladas por laser em peixe-zebra usando microscopia confocal

Comece com uma larva de peixe-zebra contendo células interneuromastóides marcadas com fluorescência ou INMCs, montadas em uma lamínula e colocadas sob um microscópio confocal.

As INMCs são células progenitoras com capacidade regenerativa que foram previamente submetidas à ablação a laser.

Primeiro, observe a área danificada no modo de fluorescência. A ausência de fluorescência confirma a ablação a laser bem-sucedida.

Em seguida, use o modo de imagem de luz transmitida para examinar a área danificada onde a célula parece granular e inchada com núcleos irregulares, confirmando a morte celular.

O recrutamento de macrófagos para o local indica uma resposta celular ativa à lesão.

Agora, volte para o modo de fluorescência e capture imagens de lapso de tempo em intervalos regulares para monitorar a recuperação.

Durante a fase de recuperação, os INMCs estendem as projeções para a lacuna, facilitando o fechamento e promovendo o reparo celular.

Salve essas imagens de séries temporais para análise. O reaparecimento de fluorescência distinta na área ablacionada confirma a recuperação celular bem-sucedida.

Para imagens dos corpos celulares pós-ablação, no menu Canais, desmarque a trilha DAPI para inativar o laser de ablação e abra o menu do modo de aquisição. Clique em Zoom e diminua o zoom para 0,7.

Para avaliar o sucesso da ablação celular, faça uma varredura rápida do campo de visão. Usando as mesmas configurações da imagem de pré-ablação, capture e salve uma imagem pós-ablação. Inspecione a imagem do canal do tubo fotomultiplicador de luz transmitida para confirmar ainda mais o dano celular. As células danificadas demonstrarão uma aparência granular e os núcleos freqüentemente incharão ou parecerão irregulares.

Para avaliar a recuperação do corpo celular pós-ablação, ative as opções de posição do estágio e tempo para captura de imagem de lapso de tempo e defina os parâmetros de tempo para o ponto de tempo experimental apropriado e intervalos de 15 minutos. Em seguida, inicie o experimento para adquirir imagens e salve o arquivo resultante quando concluído.