Visualizando a morfologia dos astrócitos usando iontoforese de corante fluorescente em uma fatia de cérebro de camundongo fixa

Coloque uma fatia de cérebro de rato quimicamente fixada em um prato com fundo de vidro contendo tampão e prenda-a com uma tela.

Conecte um eletrodo preenchido com um corante fluorescente hidrofílico aniônico a uma fonte de tensão.

Insira um eletrodo de aterramento no buffer para completar o circuito elétrico.

Usando iluminação de campo claro, avance o eletrodo preenchido com corante em direção à fatia.

Mude para imagens de contraste de interferência diferencial infravermelha para localizar um astrócito.

Perfure o soma do astrócito com o eletrodo para acessar o citoplasma.

Aplique uma corrente elétrica para conduzir o corante para o citoplasma por meio de iontoforese.

Mude para microscopia confocal para monitorar o movimento do corante.

O corante hidrofílico, incapaz de atravessar a membrana hidrofóbica, difunde-se dentro do citoplasma para preencher o soma e os ramos.

Assim que a célula estiver cheia, pare a corrente e retire o eletrodo.

Deixe a membrana do astrócito selar novamente.

Adquira imagens em vários planos Z e reconstrua-as para visualizar a morfologia dos astrócitos.

Para o teste de injeção de corante, coloque delicadamente uma fatia de cérebro levemente fixada em um prato com fundo de vidro cheio de PBS 0,1 molar à temperatura ambiente. E segure a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de náilon.

Conecte o eletrodo a um voltage fonte e coloque o eletrodo de aterramento no banho contendo a fatia de cérebro. Mova a objetiva de um microscópio confocal para a região do cérebro de interesse.

E abaixe o eletrodo na solução usando a lente de imersão em água 10x, movendo o eletrodo para o centro do campo de visão. Em seguida, sob campo claro, abaixe lentamente o eletrodo em direção à fatia, parando logo acima da superfície.

Para preencher um astrócito de interesse com iontoforese, use o contraste de interferência diferencial infravermelho para identificar astrócitos com somates alongados e ovais, com cerca de 10 micrômetros de diâmetro, 40 a 50 micrômetros abaixo da superfície da fatia.

Este é o estrato radiado do hipocampo diretamente abaixo da camada de células piramidais. À medida que nos movemos pelo tecido, podemos ver vasos sanguíneos, neurônios, astrócitos e outros tipos de células.

Uma vez que um astrócito tenha sido selecionado, mova a célula para o centro do campo de visão e abaixe lentamente a ponta do eletrodo na fatia. Navegar pelo tecido até que o eletrodo esteja no mesmo plano do corpo celular.

Uma vez que o corpo celular do astrócito esteja claramente visível e delineado, avance lenta e suavemente o eletrodo para frente, movendo o eletrodo até que a ponta empale o soma da célula.

Mova o foco da objetiva lentamente para cima e para baixo para observar se o eletrodo está dentro do soma. Assim que a ponta do eletrodo estiver dentro da célula, ligue o estimulador em 0.5 a 1 volt para ejetar continuamente a corrente na célula.

Usando o microscópio confocal, observe o preenchimento da célula, aumentando o zoom digital para visualizar os detalhes da célula e certificar-se de que a ponta do eletrodo esteja visível dentro da célula, conforme necessário.

Aguarde cerca de 15 minutos até que os ramos e processos mais finos pareçam definidos, antes de desligar a tensão e retirar suavemente a ponta do eletrodo da célula.

Para obter imagens da célula preenchida, aguarde de 15 a 20 minutos para que a célula retorne à sua forma original, antes de ajustar a configuração no microscópio confocal para garantir que os ramos e processos mais finos apareçam definidos sob a objetiva de 40x.

Configure uma pilha z com um tamanho de passo de 0,3 micrômetros, movendo a objetiva durante a imagem até que não haja sinal da célula. E defina essa etapa como o topo.

Em seguida, mova a objetiva para baixo, focando através da célula até que não haja sinal. E defina essa etapa como a parte inferior.