Visualização do influxo de cálcio em neurônios do mesencéfalo ventral derivados de embriões de camundongos

Pegue uma lamínula com uma cultura de neurônios do mesencéfalo ventral derivados de embriões de camundongos.

As células são infectadas com um vetor viral para expressar um indicador de cálcio.

Transfira a lamínula para a câmara de registro de um microscópio confocal perfundido com um tampão de registro.

Usando luz visível, identifique uma região contendo vários neurônios e, em seguida, mude para imagens de fluorescência.

Em baixos níveis de cálcio intracelular, o indicador permanece não ligado, exibindo baixa intensidade de fluorescência.

As propriedades intrínsecas dos neurônios geram potenciais de ação espontâneos, fazendo com que os canais de cálcio dependentes de voltagem se abram e permitam o influxo de cálcio.

O excesso de cálcio se liga ao indicador, induzindo uma mudança conformacional que aumenta a intensidade da fluorescência.

Registre a intensidade da fluorescência ao longo do tempo para rastrear a atividade espontânea do cálcio.

Introduza um neurotransmissor em alta concentração, que se liga a receptores nos neurônios, gerando potenciais de ação contínuos.

A ativação sustentada do canal de cálcio dependente de voltagem prolonga o influxo de cálcio, causando um aumento sustentado na intensidade da fluorescência.

Prepare 1 litro do tampão de registro HEPES, 200 mililitros de tampão de registro de glutamato 20 micromolar e 200 mililitros de tampão de registro NBQX 10 micromolar de acordo com as instruções do manuscrito. Encha uma placa de Petri milimétrica estéril com 3 mililitros do tampão de registro.

Pegue a placa de Petri com as culturas infectadas da incubadora, em seguida, pegue cuidadosamente a borda de uma lamínula com uma pinça de ponta fina e transfira-a para a placa com o tampão de gravação. Coloque a lamínula restante no meio de volta à incubadora de 37 graus Celsius e transporte o prato com tampão de gravação para o microscópio confocal.

Inicie o software de imagem. Enquanto estiver inicializando, inicie a bomba peristáltica e coloque a linha no buffer de gravação. Em seguida, calibre o fluxo para 2 mililitros por minuto. Transfira a lamínula infectada da placa de Petri para o banho de registro com uma pinça fina. Usando a objetiva de imersão em água de 10x e a luz de campo claro, encontre o plano de foco e procure uma região com alta densidade de corpos celulares de neurônios. Em seguida, mude para a objetiva 40X e reoriente a amostra.

Selecione e aplique Alexa Flour 488 na janela da lista de corantes. Para evitar a superexposição e o fotobranqueamento dos fluoróforos, comece com configurações baixas de HV e potência do laser. Para o canal Alexa Fluor 488, defina o HV para 500, o ganho para 1x e o deslocamento para zero. Defina a potência para 5% para a linha de laser 488, aumente o tamanho do orifício para 300 micrômetros e use a opção de varredura focus x2 para ajustar de maneira ideal os sinais de emissão para níveis de subsaturação.

As configurações podem ser ajustadas para visibilidade ideal de cada canal. Depois que as configurações do microscópio estiverem otimizadas, mova a platina para localizar uma região com várias células exibindo alterações espontâneas na fluorescência do GCaMP6f e concentre-se no plano desejado para a imagem. Use a ferramenta recortar para recortar o quadro de imagem em um tamanho que possa atingir um intervalo de quadros de pouco menos de um segundo. Defina a janela de intervalo como um valor de 1,0 e a janela Num como 600.

Para capturar um filme da série T, selecione a opção de tempo e use a opção de digitalização XYt para iniciar a geração de imagens. Observe a barra de progresso da imagem e mova a linha do buffer de registro HEPES para o buffer de registro de glutamato de 20 micromolares no ponto de tempo apropriado. Quando a imagem estiver concluída, selecione o botão série concluída e salve o filme da série t finalizado. Continue a perfundir o glutamato por mais cinco minutos, de modo que os neurônios cultivados tenham sido expostos ao glutamato por um total de 10 minutos.

Repita esse processo para cada lamínula a ser fotografada. É possível visualizar traços de cálcio em corpos celulares neuronais imediatamente após o experimento. Use a ferramenta de elipse para desenhar o número desejado de ROIs em torno do soma neuronal e use o botão de análise de série para visualizar os traços. Após a exposição adicional de cinco minutos ao glutamato, remova a lamínula do banho com uma pinça fina e coloque-a de volta na placa de Petri com o tampão de gravação até que todas as imagens sejam concluídas.