Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:41 min. • May 29th, 2025
Pegue uma cultura neuronal de hipocampo de rato de curto prazo representando neurônios jovens e uma cultura de longo prazo representando neurônios envelhecidos.
Os neurônios envelhecidos exibem uma densidade mais alta de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L, ou L-VGCCs, que permanecem abertos por mais tempo após a despolarização da membrana.
Incube com um indicador fluorescente de cálcio que se difunde nas células e, em seguida, lave para remover qualquer excesso de corante.
Colocar as culturas numa câmara de perfusão ao microscópio de fluorescência.
Introduza uma solução contendo neurotransmissores que se ligam a receptores nos neurônios, induzindo o influxo de íons de sódio e desencadeando a despolarização da membrana.
A despolarização ativa os L-VGCCs, permitindo o influxo de cálcio no citoplasma.
Na cultura de longo prazo, a maior densidade e a abertura prolongada de L-VGCCs levam à sobrecarga de cálcio, uma marca registrada do envelhecimento neuronal.
A ligação do cálcio ao indicador gera fluorescência, com neurônios envelhecidos exibindo maior intensidade de fluorescência, refletindo o aumento dos níveis de cálcio intracelular após a estimulação.
Neste procedimento, incubar as células com Fura2-AM durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, transferir as lamínulas para a câmara de perfusão. Em seguida, coloque a câmara de perfusão com a lamínula no suporte do microscópio invertido. Selecione o campo microscópico e perfunda as células continuamente com HBS pré-aquecido.
Posteriormente, epi-ilumine as células a 340 e 380 nanômetros e, em seguida, registre a luz emitida a 520 nanômetros a cada 5 a 10 segundos com uma câmera de fluorescência, que é filtrada por um espelho dicróico Fura-2. Analisar as imagens fluorescentes gravadas. Primeiro, abra o arquivo de experimento.
Usando o software AquaCosmos, clique em Ratio e selecione a faixa de proporção desejada. Calcule a proporção pixel a pixel nas imagens resultantes para obter uma sequência de imagens de proporção. Em seguida, subtraia o fundo ajustando o botão de iluminação do fundo. Depois disso, pressione Iniciar cálculo. em seguida, pressione o botão All Time Sequence e apague os ROIs antigos.
Para análise quantitativa de células individuais, estabeleça novas ROIs ou as ROIs correspondentes aos neurônios individuais. Para representar graficamente as gravações individuais, exporte os valores de fluorescência da proporção correspondentes a cada ROI para o programa do laboratório de origem clicando em Gráfico. Em seguida, clique em Calcular e salve o arquivo TXT. Depois disso, faça o cálculo correspondente para estimar o tamanho do aumento na taxa de fluorescência em resposta a cada estimulação.