JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:14 min • May 29th, 2025
Comece com seções cerebrais de um modelo de camundongo neurodegenerativo.
Incube com uma solução de bloqueio suplementada com detergente para aumentar a permeabilidade do tecido e bloquear a ligação não específica. Descarte a solução.
Introduzir anticorpos primários direcionados a placas beta-amiloide. Incube com agitação para que os anticorpos interajam com as placas beta-amilóide e, em seguida, lave.
Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo vermelho e incube no escuro para permitir que os anticorpos interajam.
Lave para remover anticorpos não ligados, seguido de uma lavagem com álcool.
Adicione a curcumina, que se liga aos amiloides ricos em folhas beta com alta afinidade, e lave.
Em seguida, trate com concentrações crescentes de álcool, desidratando as seções cerebrais. Adicione xileno para remover quaisquer vestígios de reagentes.
Monte uma seção em uma lâmina e observe sob um microscópio de fluorescência.
Use um laser de comprimento de onda de 590 nanômetros para excitar os fluoróforos vermelhos nos anticorpos secundários. Capture a imagem.
Mude para um laser de comprimento de onda de 480 nanômetros para excitar a curcumina, emitindo fluorescência verde.
Sobreponha as imagens; a colocalização de fluorescência vermelha e verde confirma a placa beta-amilóide no tecido cerebral.
Para a marcação de amostras seccionadas por criostato com anticorpos anti-A beta, lave as amostras três vezes com PBS fresco por lavagem em poços individuais de uma placa de 12 poços antes de bloquear qualquer ligação inespecífica com 10% de soro de cabra normal em PBS e 0,5% de Triton x-100 por uma hora em temperatura ambiente.
No final da incubação, descarte a solução de bloqueio e incube as amostras com um anticorpo específico beta A durante a noite a 4 graus Celsius e 150 rotações por minuto. Na manhã seguinte, lave as seções com três lavagens de 10 minutos em PBS fresco por lavagem, seguidas de incubação com um anticorpo secundário apropriado conjugado com um fluoróforo vermelho por uma hora em temperatura ambiente protegido da luz.
No final da incubação, lave as seções três vezes com PBS seguidas de uma lavagem com álcool 70%. Após a lavagem com álcool, incube as seções com curcumina 10 micromolares por 10 minutos em temperatura ambiente, seguidas de três lavagens com álcool a 70% de um minuto.
Após a última lavagem, desidrate as seções com álcool 90% e 100% por um minuto por concentração e limpe as seções duas vezes por cinco minutos por imersão com xileno fresco por incubação. Em seguida, monte e crie a imagem das seções conforme demonstrado.