Visualização tridimensional de uma infecção pelo vírus da raiva no tecido cerebral de camundongos

Pegue uma seção cerebral grossa fixa de um camundongo infectado com o vírus da raiva.

O vírus infecta neurônios e se replica, resultando em proteínas virais presentes nas células.

Trate com um detergente para permeabilizar as membranas celulares e uma solução de bloqueio para mascarar locais de ligação não específicos.

Incubar com anticorpos primários direcionados às proteínas virais, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.

Trate com um corante fluorescente de ligação a ácidos nucleicos para rotular o núcleo.

Desidrate o tecido em concentrações crescentes de álcool e, em seguida, aplique uma solução de limpeza para aumentar a transparência do tecido para imagens.

Monte a seção em uma câmara de imagem, encha-a com a solução de limpeza e feche-a.

Usando microscopia confocal de varredura a laser, crie imagens do tecido separadamente usando as etiquetas fluorescentes e, em seguida, mescle-as para criar uma imagem bidimensional.

Adquira imagens em diferentes planos focais em todo o tecido e combine-as para gerar uma representação tridimensional para avaliar a progressão da infecção.

Para imunocoloração das seções do tecido cerebral, lave as amostras duas vezes por 1 hora em 4 mililitros de Triton X-100 a 0,2% em PBS, seguido de permeabilização por dois dias a 37 graus Celsius, em 4 mililitros de Triton X-100 a 0,2%, dimetilsulfóxido a 20% e glicina molar a 0,3 em PBS. Bloqueie qualquer ligação inespecífica com 4 mililitros de Triton X-100 a 0,2%, dimetilsulfóxido a 10% e soro normal a 6% em PBS por dois dias a 37 graus Celsius.

No final da incubação de bloqueio, rotule as amostras com 2 mililitros de solução primária de anticorpos por cinco dias a 37 graus Celsius, atualizando a solução de anticorpos após dois dias e meio. Em seguida, lave as amostras por um dia em 4 mililitros de 0,2% Tween 20 e 10 microgramas por mililitro de heparina em PBS, trocando o tampão de lavagem pelo menos quatro a cinco vezes durante o dia e deixando a lavagem final durante a noite.

No dia seguinte, incube as amostras em 2 mililitros de solução de anticorpos secundários por cinco dias a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as amostras em 4 mililitros de Tween 20 a 0,2% fresco e 10 microgramas por mililitro de heparina em PBS, conforme demonstrado.

Para coloração nuclear das amostras, incubar as amostras em 4 mililitros da coloração de ácido nucleico TO-PRO-3 por 5 horas, protegidas da luz. No final da incubação, lave as amostras em 0,2% Tween 20 e 10 microgramas por mililitro de heparina em PBS, conforme demonstrado, seguido de desidratação em uma série ascendente de terc-butanol por 2 horas por imersão.

Após a imersão a 90%, transfira as amostras para uma solução de terc-butanol a 96% durante a noite. Na manhã seguinte, desidrate as amostras ainda mais em 100% de terc-butanol por 2 horas antes de limpar as seções de tecido em BABB-D15 recém-preparado por 2 a 6 horas até que estejam opticamente transparentes. As amostras podem então ser armazenadas em BABB-D15, protegidas da luz até sua montagem e imagem.

Para montagem de amostras, use uma impressora 3D para imprimir uma câmara de imagem e tampa. Monte uma lamínula de 30 milímetros de diâmetro na câmara de imagem com um componente de borracha de silicone vulcanizante à temperatura ambiente. Da mesma forma, monte uma lamínula de 22 milímetros na tampa. Use um cotonete umedecido com água para remover o excesso de borracha de silicone em ambos os anéis antes de permitir que a borracha cure durante a noite.

No dia seguinte, coloque uma amostra na câmara de imagem e adicione um pequeno volume de BABB-D15 à câmara antes de inserir a tampa. Usando uma agulha hipodérmica, encha a câmara com BABB-D15 através da entrada e tampe a entrada antes de selar a câmara de imagem com borracha de silicone.

Para configurar a aquisição de imagem, selecione as linhas de laser apropriadas para os fluoróforos usados e ajuste as faixas de detecção de cada detector para evitar a sobreposição de sinal entre os canais. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição, defina a borda superior e inferior da pilha e adquira a pilha de imagens.

Para gerar projeções 3D da pilha de imagens, abra os arquivos de imagem em Fiji e selecione Imagem, Cor, Ferramenta Canais, Mais e Dividir canais para dividir as imagens mescladas em canais individuais. Para correção de branqueamento das imagens para cada canal, selecione Imagem, Ajustar, Correção de branqueamento e selecione Proporção simples. Use os controles deslizantes para ajustar o brilho e o contraste de cada canal e selecione Imagem, Cor e Mesclar canais. Marque a opção Criar composto.

Converta a imagem para o formato RGB e selecione Imagem, Pilhas e projeto 3D para gerar uma projeção 3D. Selecione o ponto mais brilhante como o método de projeção e defina o espaçamento entre fatias para corresponder ao tamanho da etapa Z da pilha de imagens adquirida. Para obter a máxima qualidade, defina o incremento do ângulo de rotação como 1 e ative a interpolação. Modifique a rotação total, os limites de transparência e a opacidade conforme necessário. Em seguida, salve a projeção 3D como ambos . Formatos de arquivo TIFF e .AVI.