Visualização de projeções de neurônios motores e ramificação de axônios usando microscopia de fluorescência de folha de luz

Pegue um segmento de tecido quimicamente fixado e limpo de um embrião de camundongo transgênico expressando proteína fluorescente verde (GFP) em neurônios motores espinhais.

Monte o tecido verticalmente em uma ponta de pipeta modificada.

Prenda a ponta a um capilar preso dentro do microscópio de fluorescência de folha de luz.

Coloque uma câmara de amostra cheia de tampão sob o tecido para mergulhá-lo e limpar os detritos.

Usando um software de imagem, alinhe o tecido no caminho da luz.

Inicie a aquisição da imagem.

A fonte de luz emite uma fina folha de luz laser, excitando GFPs em um único plano do tecido para emitir fluorescência.

Um detector posicionado perpendicularmente ao caminho da luz captura a fluorescência emitida.

Adquira imagens dos neurônios motores espinhais para gerar uma reconstrução 3D da morfologia da ramificação axonal.

Use software para mapear axônios, identificando padrões de ramificação e endpoints para avaliar o crescimento e a conectividade dos neurônios motores.

Configure a óptica de iluminação 5X/0.1 e a óptica de detecção 5X/0.16. Monte o porta-amostras e o capilar da amostra. Preparar a câmara de recolha de amostras enchendo-a com uma solução de limpeza. Para montar o embrião, prepare uma ponta de pipeta P200 cortando a parte superior para que ela se ajuste ao diâmetro do capilar e remova a parte pontiaguda para a fixação da amostra.

Em seguida, derreta a extremidade embotada da ponta da pipeta usando uma pequena chama. Apague a chama e prenda rapidamente o embrião verticalmente na extremidade derretida. Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com o capilar de amostra e coloque a câmara de amostra preparada no microscópio. Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar na guia Localizar e ajuste os eixos xy e z.

Em seguida, selecione Localizar amostra e amplie para 0,6X para focar no embrião. Deixe o tampão da câmara se equilibrar com o embrião por algum tempo para limpar quaisquer detritos ou bolhas. Para aquisição de imagem na guia Aquisição, defina os parâmetros do caminho da luz, como objetivos de detecção, filtro de bloqueio de laser, divisor de feixe, câmeras e lasers.

Marque a caixa de seleção de varredura dinâmica para redução de sombra. Em seguida, defina as configurações de aquisição, profundidade de bits para 16 bits. Amplie para a faixa entre 0,36 e 0,7X iluminação de um lado ou iluminação de dois lados. Clique em Contínuo e defina a intensidade do laser, o tempo de exposição, a potência do laser e a posição da folha de luz. Em seguida, pressione parar para encerrar a aquisição da imagem.

É importante garantir que a amostra transparente esteja posicionada dentro do caminho de luz mais curto para permitir a aquisição detalhada de imagens de estruturas eretas finas em nervos motores individuais.

Para aquisição multidimensional, defina a pilha Z movendo a posição Z para a primeira e a última imagem. Clique em Ideal para definir o número da fatia. Em seguida, clique em Iniciar experimento para adquirir a pilha Z selecionada. Quando terminar, salve a imagem no formato dot CZI.

Para quantificar a arborização do axônio, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagem. Ajuste a cor, o brilho e o contraste da imagem usando a janela de ajuste de exibição para detectar filamentos com base no contraste de intensidade local. Em seguida, clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecione o algoritmo de caminho automático no menu suspenso. Selecione a região de interesse.

Em seguida, defina os pontos inicial e inicial atribuindo as medidas de diâmetro maior e mais fino, que podem ser medidas usando o modo de fatia. Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para obter a adição ou remoção manual de pontos de partida, primeiro altere o modo de ponteiro, Navegar Selecionar e, em seguida, shift e clique com o botão direito do mouse nos pontos de interesse.

Em seguida, selecione Limites manuais para pontos iniciais para garantir que toda a arborização visível esteja marcada. Em seguida, adicione ou remova manualmente os pontos de semente. Marque a caixa Remover segmentos desconectados e remova os pontos iniciais ao redor dos pontos iniciais. Em seguida, ajuste o Limite para subtração de fundo e conclua o processo.

É necessário remover artefatos de fundo e confirmar que o caminho do detector reflete a verdadeira arborização do axônio para uma quantificação precisa.

No final, escolha o estilo e a cor desejados. Na guia Estatísticas, selecione detalhado e use os pontos terminais dendríticos do número de filamentos para quantificar os terminais nervosos motores como um indicador da arborização do axônio motor. Em seguida, exporte a imagem do axônio reconstruído como um . Arquivo TIFF.