Imagem histoquímica de módulos corticais em seções cerebrais achatadas

Comece com seções tangenciais pré-fixadas das seções corticais do cérebro achatadas. Lavar para remover os vestígios de fixação.

Manjar as secções com uma solução de diaminobenzidina ou DAB e sulfato de níquel-amónio.

O

DAB difunde-se nos neurónios corticais e reage com a citocromo oxidase nas mitocôndrias, formando um precipitado escuro. O sulfato de níquel-amônio escurece o precipitado, aumentando o contraste.

Adicione paraformaldeído para interromper a reação de coloração e depois enxágue.

Monte as seções em uma lâmina e desidrate-as com lavagens com etanol.

Enxágue com isopropanol e xileno para limpar a seção e melhorar a transmissão de luz.

Aplique um meio de montagem e coloque uma lamínula nele.

Quando fotografados sob um microscópio de campo claro, dentro dos neurônios corticais, os precipitados absorvem e espalham a luz, fazendo com que pareçam escuros.

Em contraste, áreas limpas e sem manchas transmitem luz e parecem brilhantes.

Esse contraste destaca os módulos corticais como estruturas escuras e irregulares contra um fundo mais claro, representando clusters neurais ativos envolvidos no processamento de informações sensoriais.

Lave o tecido de corte em tampão HEPES por 15 minutos com agitação suave. Durante a lavagem, prepare uma solução de coloração citocromo oxidase fresca e adicione o componente DAB antes de usá-lo. Agora, incube as seções na solução de coloração recém-feita em temperatura ambiente com agitador. E fique atento. Dependendo da quantidade de fixação, a coloração pode ser observada em 10 minutos ou pode levar várias horas.

Se a reação estiver muito lenta, aumente a temperatura para 37 graus Celsius. Para interromper a reação, transfira as seções para um banho de PFA a 4% e deixe-as incubar por 15 minutos com agitação suave. Em seguida, lave as seções três vezes com tampão HEPES por 10 minutos por lavagem.

Agora, monte e seque as seções em lâminas de vidro e desidrate-as usando banhos de etanol progressivamente mais fortes. Em seguida, lave as lâminas em isopropanol por 5 minutos, seguido de xileno por cinco minutos. Após o banho de xileno, adicione imediatamente um meio de montagem não à base de água de endurecimento rápido. Meios à base de água degradam a mancha. Depois de adicionar uma lamínula, armazene os slides a 4 graus Celsius até que sejam fotografados.