Análise de células imunes em tecidos nervosos de camundongos usando citometria de fluxo

Pegue células isoladas de nervos ciáticos de camundongos e gânglios da raiz dorsal ou DRGs.

Incube com anticorpos marcados com fluoróforo contra CD45 e CD11b e com anticorpos marcados com biotina contra MHC classe II, para marcar células imunes.

Incubar com estreptavidina marcada com fluoróforo que se liga à biotina.

Trate com um fixador para estabilizar a estrutura celular.

Introduza um tampão de permeabilização com uma coloração de DNA fluorescente para permeabilizar as membranas e rotular os núcleos.

Usando um citômetro de fluxo, passe as células pelo feixe de laser para avaliar as características ópticas e de fluorescência.

Remova agregados com maior fluorescência de DNA para isolar células individuais e detectar a fluorescência dos marcadores.

Identifique as células que expressam CD45, um marcador característico das células imunes, confirmando sua presença.

A maioria das células CD45-positivas no DRG expressa CD11b e MHC classe II, indicando células semelhantes à microglia, que estão ausentes nos nervos ciáticos.

Essa técnica complementa a imagem para analisar a heterogeneidade das células imunes nos tecidos nervosos.

No computador, selecione os canais apropriados para detecção dos fluoróforos de interesse, a taxa de fluxo apropriada para as amostras e o número total de eventos a serem coletados por amostra. O número mínimo de eventos deve ser de 1 milhão.

Em seguida, crie gráficos de dispersão em uma planilha global da dispersão lateral A versus a dispersão direta A, bem como para cada fluoróforo de interesse versus a dispersão direta A. Além disso, crie uma visualização estatística que exibirá o número de eventos e a intensidade média de fluorescência para os fluoróforos selecionados.

Determine a porta pai P1 com base no gráfico de dispersão dos controles de coloração somente DAPI. Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em Adquirir. Observe o gráfico DAPI versus FSC e reduza a voltagem do canal DNA Pacific Blue até que a população DAPI-plus se torne visível. Usando a ferramenta de passagem de retângulo, desenhe uma caixa ao redor da população DAPI-plus. Isso representa a porta P1. Selecione os gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos e exiba apenas os eventos DAPI-plus. Isso representa a fluorescência de fundo para cada um dos fluoróforos.

Usando a ferramenta de passagem de retângulo, desenhe uma caixa nos gráficos de dispersão para cada um dos fluoróforos, começando em 103 no eixo y. Esta porta representa a região em que os eventos positivos para cada um dos marcadores declarados devem ser encontrados. Ajuste as tensões para cada um dos fluoróforos usando os controles de coloração somente DAPI. Anexe a amostra à citometria de fluxo e clique em Adquirir.

Observe a posição da população DAPI-plus para cada um dos fluoróforos e ajuste as respectivas tensões de modo que as populações fiquem fora da porta retangular. Uma vez que o citômetro de fluxo tenha sido configurado, execute as amostras e exporte os arquivos de dispersão direta para análise posterior.