Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Pegue uma solução de agarose pré-aquecida contendo uma larva de peixe-zebra transgênica anestesiada expressando uma proteína fluorescente nos neurônios motores espinhais.

Transfira a larva para um prato de vidro com um anel de agarose.

Usando um microscópio, vire a larva de lado. Em seguida, deixe a agarose solidificar, imobilizando a larva.

Adicione tampão contendo anestésico para manter a anestesia.

Coloque a placa no microscópio confocal e use imagens de campo claro para localizar a região dorsal da medula espinhal.

Mude para o modo de fluorescência para visualizar neurônios motores fluorescentes.

Determine o plano z central do soma celular para um direcionamento preciso da ablação.

Configure os parâmetros de imagem para aquisição de alta resolução, minimizando o fotodano.

Uma vez que o plano z desejado esteja em foco, realize a ablação na região do neurônio alvo usando um laser ultravioleta focado.

A energia do laser interrompe as estruturas celulares, causando perda de fluorescência e morte celular. A perda irreversível de fluorescência confirma a ablação precisa sem afetar as células circundantes.

Use uma pipeta ajustável para retirar uma larva e deixe-a afundar até o fundo da po