Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Pegue uma solução de agarose pré-aquecida contendo uma larva de peixe-zebra transgênica anestesiada expressando uma proteína fluorescente nos neurônios motores espinhais.

Transfira a larva para um prato de vidro com um anel de agarose.

Usando um microscópio, vire a larva de lado. Em seguida, deixe a agarose solidificar, imobilizando a larva.

Adicione tampão contendo anestésico para manter a anestesia.

Coloque a placa no microscópio confocal e use imagens de campo claro para localizar a região dorsal da medula espinhal.

Mude para o modo de fluorescência para visualizar neurônios motores fluorescentes.

Determine o plano z central do soma celular para um direcionamento preciso da ablação.

Configure os parâmetros de imagem para aquisição de alta resolução, minimizando o fotodano.

Uma vez que o plano z desejado esteja em foco, realize a ablação na região do neurônio alvo usando um laser ultravioleta focado.

A energia do laser interrompe as estruturas celulares, causando perda de fluorescência e morte celular. A perda irreversível de fluorescência confirma a ablação precisa sem afetar as células circundantes.

Use uma pipeta ajustável para retirar uma larva e deixe-a afundar até o fundo da ponta. Coloque a larva em um volume mínimo de líquido na agarose pré-aquecida, retire o peixe com agarose e distribua-o rapidamente em um prato de 35 milímetros com fundo de vidro previamente preparado. Sob um microscópio de dissecação, use um pincel padrão para posicionar o animal, ou vários animais, dentro da agarose de lado, de modo que o corpo e a cauda fiquem planos.

Deixe o peixe embutido descansar por 10 a 15 minutos até que a agarose esteja firmemente firme. Em seguida, use aproximadamente dois mililitros de água de ovo com trikane para completar cuidadosamente a placa de Petri de 35 milímetros. Coloque a placa de Petri com uma larva embutida no estágio do microscópio confocal e, usando iluminação de campo claro e ampliação de 40X, concentre-se no lado dorsal da medula espinhal do animal. Mude para uma configuração fluorescente apropriada e visualize a estrutura de interesse para confirmar se todos os parâmetros de imagem são necessários para a ablação subsequente.

Para determinar a espessura da estrutura para ablação a laser UV, use a unidade Z para verificar a parte superior e inferior da estrutura de interesse focando manualmente para cima e para baixo. Registre manualmente o plano Z que será ablacionado, por exemplo, o centro da célula. Para realizar a ablação a laser, inicie o assistente FRAP clicando no menu suspenso na parte superior do menu do software.

Na nova janela, determine os parâmetros de imagem para a abordagem de ablação selecionando o formato, a velocidade de digitalização e a média. Se o plano Z para ablação ainda não tiver sido selecionado, pressione o botão ao vivo e foque através da amostra até que a estrutura fluorescente ou o plano Z desejado a ser ablacionado esteja em foco. Depois que os parâmetros gerais da imagem forem definidos, acesse a etapa de branqueamento para controlar os componentes de ablação específicos e, em seguida, acione o laser de 405 nanômetros ativando-o para o procedimento de branqueamento.

Em seguida, use a opção de zoom para maximizar a intensidade do branqueamento no ROI selecionado, reduzindo o campo de varredura, maximizando assim o tempo de permanência. Selecione uma ou várias ROIs para a ablação usando qualquer uma das ferramentas de desenho na janela de aquisição de imagem. Mire no outeiro do axônio, por exemplo, com a ferramenta de desenho circular de aproximadamente 4 a 8 micrômetros.

Depois de estabelecer o ROI, selecione o botão do curso de tempo e confirme o número de ciclos em que os ROIs serão digitalizados e ablacionados. Escolha as molduras pré-branqueamento e pós-branqueamento conforme desejado para permitir uma visão geral de toda a imagem imediatamente antes e imediatamente após o processo de branqueamento.

Essas configurações permitem aos pesquisadores várias camadas de refinamento. Através do ajuste da potência do laser, velocidade de varredura, média da linha, tamanho da região de interesse e repetições, essa técnica oferece um alto grau de liberdade para causar estresse ou morte em células individuais.

Depois de estabelecer todos os parâmetros de ablação necessários, pressione Executar experimento e monitore a eficiência da ablação. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais.