JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:35 min • May 29th, 2025
Pegue um cérebro de filhote de camundongo quimicamente fixado com malformações cavernosas cerebrais ou CCMs - aglomerados de vasos sanguíneos anormais cheios de sangue estagnado.
Isole o rombencéfalo, enxágue com tampão e incube em uma solução de coloração à base de iodo.
O iodo penetra nos vasos sanguíneos permeáveis nas áreas da CCM, liga-se aos componentes do sangue e aumenta o contraste da lesão.
Seque o tecido ao ar para remover o excesso de solução de coloração.
Coloque o tecido em um tubo e sele para evitar o encolhimento do tecido.
Prenda o tubo dentro de um tubo maior com esponjas e monte-o verticalmente no suporte de micro-CT.
Inicie a verificação.
A fonte de raios-X emite raios-X concentrados que passam pelo tecido.
As áreas manchadas de iodo absorvem mais raios-X do que o tecido circundante.
O detector registra os raios-X transmitidos, gerando imagens onde os CCMs parecem mais brilhantes.
O sistema gira o tecido, capturando imagens 2D de vários ângulos.
Um software especializado reconstrói essas imagens em um modelo 3D, revelando locais de CCM no cérebro.
Comece a preparação da amostra enchendo uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 29 com três mililitros de paraformaldeído a 2% em PBS. Em seguida, realize a perfusão intracardíaca em um filhote P8 sacrificado, inserindo a agulha no ventrículo do coração do camundongo e injetando lentamente todo o volume de paraformaldeído.
Depois de usar uma tesoura para separar a cabeça, remova a pele da cabeça e retire o crânio, usando uma pinça para dissecar todo o cérebro em paraformaldeído a 4% em PBS. Fixe os cérebros durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, retire os cérebros posteriores usando uma pinça e enxágue com solução de PBS.
Em seguida, incube os cérebros posteriores na solução de iodo de Lugol por 48 horas. Após a incubação, seque brevemente o cérebro posterior para remover o excesso de solução de iodo de Lugol. Em seguida, embale os cérebros posteriores corados com iodo de Lugol em tubos de microcentrífuga de 0,65 microlitro e sele completamente com filme plástico de parafina para evitar o encolhimento do tecido. Coloque os tubos de microcentrífuga em tubos de plástico de cinco mililitros com esponjas para evitar que se movam durante a varredura.
Monte verticalmente o tubo contendo um rombencéfalo em um suporte de alumínio no sistema micro-CT. Defina os parâmetros de digitalização. Use 540 projeções em um tempo de exposição de dois segundos, com condições de fonte de 50 quilovolts e 10 watts para adquirir os conjuntos de dados tomográficos. As radiografias do scanner o reconstroem automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseado em hardware fornecido pelo sistema de micro-CT, produzindo uma série de imagens de cortes axiais de 16 bits.