Imagem de fluorescência dupla para identificar oligodendrócitos diferenciados

Pegue uma cultura de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), isoladas de um cérebro de filhote de rato, que foram induzidas a se diferenciar em oligodendrócitos. As células são fixadas para preservar a arquitetura celular.

Os oligodendrócitos diferenciados expressam a proteína básica da mielina, ou MBP, um marcador de oligodendrócitos maduros, enquanto as OPCs e as células diferenciadas expressam o fator de transcrição de oligodendrócitos 2, ou Olig2.

Aplique uma solução de bloqueio de permeabilização e incube com agitação, permeabilizando as membranas celulares e bloqueando locais de ligação não específicos.

Adicione anticorpos primários direcionados aos marcadores e incube com agitação para permitir a ligação.

Lave para remover os anticorpos não ligados, adicione diferentes anticorpos secundários conjugados com fluoróforo específicos para os anticorpos primários e incube com agitação.

Lave as células e coloque-as em um sistema de imagem de fluorescência dupla.

Use luz de comprimentos de onda específicos para excitar os fluoróforos distintos e detectar os sinais emitidos para visualizar os marcadores.

Identifique oligodendrócitos diferenciados expressando olig2 e MBP entre os OPCs indiferenciados expressando apenas olig2.

Leve o prato à temperatura ambiente. Aspire os poços e adicione 250 microlitros de DPBS contendo 5% de NGS e 0,1% de Triton X-100. Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital suave. Preparar a solução de incubação primária diluindo o anticorpo monoclonal anti-MBP de ratinho e o anticorpo policlonal anti-OLIG2 de coelho em panquiderico contendo 5% de NGS. Em seguida, incube os anticorpos primários a 4 graus Celsius durante a noite por 16 a 18 horas com uma leve agitação orbital.

Enquanto lava a placa, prepare a solução de incubação secundária diluindo os anticorpos anti-rato 680 e anti-coelho 800 em DPBS contendo 5% de NGS. Em seguida, aspire a lavagem final e adicione 250 microlitros de solução de incubação secundária. Proteja a placa da luz e incube-a em temperatura ambiente por uma hora com uma agitação orbital suave.

Depois disso, escaneie a placa usando um sistema de imagem capaz de detectar emissões de fluorescência de 700 nanômetros e 800 nanômetros. Como ponto de partida, defina o deslocamento focal para 3 e as sensibilidades para 1,5 para MBP, 5,0 para actina e 3,5 para OLIG2. Ajuste os valores de sensibilidade conforme necessário para evitar a superexposição do sinal.