Medindo a expressão de proteínas no cérebro de roedores usando fluorescência de infravermelho próximo e varredura de alta resolução

Pegue uma lâmina de vidro contendo seções de tecido cerebral de rato imunomarcadas para receptores AMPA e NMDA nos neurônios da amígdala.

Os receptores AMPA medeiam o influxo de sódio induzido pelo glutamato e a transmissão sináptica excitatória rápida.

Em contraste, os receptores NMDA medeiam o influxo de sódio e cálcio induzido pelo glutamato e co-agonista, facilitando a transmissão sináptica excitatória lenta.

Os receptores são corados com anticorpos primários e detectados usando anticorpos secundários marcados com fluoróforo no infravermelho próximo.

Coloque a lâmina com o lado do tecido voltado para baixo na interface de varredura de infravermelho próximo.

Ajuste os parâmetros de imagem e comece a criar imagens.

Após a iluminação do laser, os fluoróforos nos receptores AMPA e NMDA emitem fluorescência.

A imagem de infravermelho próximo minimiza a autofluorescência, aumentando a clareza do sinal.

A varredura de alta resolução garante ainda uma diferenciação clara dos sinais de fluorescência, permitindo a visualização precisa dos receptores AMPA e NMDA próximos na amígdala.

Usando um software de imagem, calcule a razão de intensidade de fluorescência AMPA/NMDA em uma região específica de interesse como um marcador de aprendizado e memória.

Coloque as lâminas na interface de varredura de infravermelho próximo com o tecido voltado para baixo. Crie imagens de vários slides de uma vez usando uma ferramenta de seleção. Visualize os slides usando a configuração de qualidade mais alta, com uma resolução de 21 micrômetros. Em um deslocamento de 0 nanômetros, importe imagens para o software de análise de imagem para visualizar e marcar para análise semiquantitativa de proteínas.

Depois de abrir o software de análise de imagem, selecione a área de trabalho na qual a imagem foi digitalizada. Em seguida, abra a imagem digitalizada no software de Análise de Imagem para visualizar a digitalização e ajuste os comprimentos de onda, contraste, brilho e ampliação mostrados sem alterar a imagem bruta ou a emissão total quantificada.

Depois de identificar as regiões-chave para quantificação, selecione a guia Análise na parte superior da página e, em seguida, selecione Desenhar retângulo para desenhar um retângulo sobre a área que será quantificada. Para exibir o tamanho do retângulo, selecione Formas na parte inferior esquerda da tela. Em seguida, selecione Colunas no canto inferior direito. Em seguida, adicione as colunas Altura e Largura para identificar o tamanho da forma. Por fim, nomeie a forma e repita. Depois que todas as regiões forem amostradas, prossiga com a combinação e análise dos dados disponíveis na guia Colunas.