Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 5:37 min. • May 29th, 2025
Comece com uma seção de tecido cutâneo epidérmico contendo fibras nervosas intraepidérmicas ou IENFs, terminações finas de neurônios sensoriais.
Os IENFs são ricos em mitocôndrias, fornecendo energia para a transmissão do sinal dos neurônios.
O tecido tem IENFs, mitocôndrias e núcleos epidérmicos marcados com fluorescência.
Usando um microscópio confocal invertido, adquira sequencialmente sinais fluorescentes discretos em comprimentos de onda apropriados para os núcleos, IENFs e mitocôndrias.
Ative uma varredura ao vivo para capturar o sinal IENF, abrangendo a camada epidérmica.
Em seguida, execute a varredura sequencial de cada sinal para eliminar a diafonia do sinal de fluorescência.
A partir da imagem combinada, usando o software, corte e isole as células epidérmicas fluorescentes azuis.
Em seguida, processe a área recortada para melhorar a resolução dos sinais IENF verdes e mitocondriais vermelhos.
Em seguida, gere uma imagem de superfície 3D para criar uma máscara para IENFs e, em seguida, sobreponha a imagem da superfície mitocondrial para isolar mitocôndrias específicas do nervo.
Na saída final, os IENFs aparecem em ciano, enquanto as mitocôndrias aparecem como minúsculas estruturas de cor magenta.
Selecione a objetiva de imersão em óleo 40x em um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Selecione os lasers e detectores apropriados para obter imagens dos núcleos, fibras nervosas e mitocôndrias. Insira os seguintes parâmetros de varredura na resolução de intensidade de 12 bits do software do microscópio. Taxa de varredura de 600 Hz com média de dois quadros e zoom de 2,2. Defina o software do microscópio para resolução lateral otimizada selecionando uma resolução de varredura de 1024 por 1024. Otimize a resolução axial e o seccionamento óptico selecionando uma abertura confocal de uma unidade arejada com um tamanho de passo z de 210 nanômetros.
Varra cada sinal separadamente e ajuste a tensão e o deslocamento do detector para remover quaisquer pixels saturados demais e insuficientes. Ative uma varredura ao vivo para o sinal nervoso e ajuste o controle de foco z para encontrar e definir os planos focais superior e inferior no software do microscópio que abrangem o sinal nervoso dentro da seção de tecido. Digitalize a série z final com varredura sequencial para eliminar a diafonia do sinal fluorescente.
Isole a epiderme do estrato córneo e da derme desenhando uma região ao redor da epiderme, usando uma ferramenta de seleção em uma imagem duplicada da imagem original. Em seguida, corte a imagem para a seleção. Calcule as funções de propagação de ponto para os sinais confocais de fluorescência verde e vermelho, usando o recurso calcular função de propagação. Em seguida, defina os parâmetros para o índice de refração médio para óleo em 1,515 e a abertura numérica para a objetiva de óleo de 40x em 1,25. Defina o orifício do detector em uma área, unidade e escolha um comprimento de onda de excitação do laser.
Use a restauração iterativa definida como 100% de confiança, limite de iteração de 10 ciclos e os PSFs verde e vermelho para a deconvolução dos sinais de fluorescência verde e vermelho. Use a ferramenta Criar superfície para criar uma superfície ao redor dos sinais nervosos deconvolvidos, selecionando o recurso suave não verificado, intensidade absoluta para limiar, um limite inferior de 3.000 e um limite superior de 65.535. Mantenha as superfícies acima de 10 voxels.
Remova as superfícies não nervosas usando a guia Editar na superfície do nervo para selecionar superfícies não nervosas únicas ou mantenha pressionada a tecla Control para selecionar várias superfícies não nervosas. Exclua as superfícies não nervosas selecionadas pressionando o botão Excluir. Use a guia Editar na superfície do nervo e pressione o botão Mascarar tudo nas propriedades da máscara.
Na nova janela, selecione Canal 5 Mitocôndrias Deconvolvidas na seleção Canal e, em seguida, marque o canal duplicado antes de aplicar a máscara. Pressione o botão de opção para constante dentro e fora e verifique a superfície externa dos voxels definidos para 0.0. E pressione o botão OK.
Por fim, crie superfícies específicas de mitocôndrias usando a ferramenta Criar superfície para criar uma superfície ao redor dos sinais mitocondriais desconvolutivos mascarados, selecionando o recurso Suavizar desmarcado e usando Subtração de fundo para limitar. Defina o diâmetro da esfera maior para 1,50 micrômetros, o limite inferior para 2.000 e o limite superior para o máximo de 65.535. Certifique-se de manter as superfícies acima de 1,0 voxels.