JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:31 min • May 29th, 2025
Comece com uma câmara de imagem contendo um explante cerebral de Drosophila imobilizado submerso em um tampão para manter a função celular.
Os neurônios no cérebro expressam indicadores citoplasmáticos fluorescentes de cálcio, que se ligam a íons de cálcio e fluoresce.
Coloque a câmara de imagem sob um microscópio de fluorescência equipado com uma lente de imersão em água.
Abaixe a lente e, sob iluminação de campo claro, foque no cérebro.
Mude para o modo de fluorescência e capture a imagem.
Em seguida, introduza um neuropeptídeo no tampão e inicie a gravação de lapso de tempo.
O neuropeptídeo se liga ao seu receptor nos neurônios, desencadeando a sinalização intracelular. Isso abre os canais de cálcio e permite o influxo de íons de cálcio.
Esses íons de cálcio se ligam aos indicadores e aumentam a intensidade da fluorescência.
Recapture a imagem após a estimulação do neuropeptídeo.
Compare as imagens antes e depois da estimulação do neuropeptídeo.
Um aumento na intensidade da fluorescência após a estimulação do neuropeptídeo reflete a resposta do cérebro da Drosophila à sinalização do neuropeptídeo.
Para adquirir imagens de fluorescência de cálcio, coloque a câmara de imagem contendo o explante cerebral sob o microscópio. Abaixe a lente objetiva até que ela toque o PBS. E sob iluminação de campo claro, posicione o cérebro e coloque-o em foco.
Mude para luz fluorescente e ajuste o foco nas células marcadas com GCaMP6. Inicie a aquisição em 250 milissegundos por quadro com uma resolução de 512 por 512 pixels no modo refrigerado a água. Em seguida, ajuste o tempo de exposição para obter os valores de fluorescência dentro da faixa dinâmica da câmera CCD, mas não inferior a 1.000 unidades arbitrárias com imagens de 16 bits.
Uma vez que os parâmetros de imagem são determinados, tire as imagens por um minuto antes da administração do peptídeo para detectar intensidades de sinal basais. Em seguida, aplique o peptídeo de teste diretamente pipetando 100 microlitros da solução peptídica preparada no banho larval. Registre a emissão do GCaMP6 por alguns minutos.