Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:25 min. • May 29th, 2025
Pegue uma seção de tecido cerebral de camundongo aparada e embebida em resina contendo o hipocampo.
A seção é corada com metais pesados para aumentar o contraste sob um microscópio eletrônico.
Monte a seção em um pino de alumínio usando cola de cianoacrilato.
Cubra os lados do bloco com pasta de prata coloidal para criar um caminho condutor para o pino de alumínio.
Examine o bloco de tecido usando um microscópio eletrônico de varredura serial (SBFSEM).
Dentro do SBFSEM, o ultramicrótomo corta sequencialmente o bloco em camadas ultrafinas enquanto um feixe de elétrons de baixa voltagem varre a superfície exposta.
Um detector de elétrons retroespalhados captura imagens 2D de alta resolução, revelando mitocôndrias e estruturas celulares circundantes.
Usando o software apropriado, ajuste o brilho e o contraste para melhorar a clareza da imagem.
Alinhe as imagens sequenciais para reconstruir um volume 3D do tecido cerebral. Esta reconstrução 3D permite o mapeamento preciso da morfologia mitocondrial, distribuição espacial e suas relações dentro dos compartimentos neuronais.
Apare as amostras na área de interesse e monte-as em um pino de alumínio usando supercola de cianoacrilato gelificante. Em seguida, cubra a amostra com pasta de prata coloidal nas laterais do bloco para fornecer um caminho condutor para o pino de alumínio. Examine as amostras de tecido usando um sistema de microscópio eletrônico de varredura equipado com um estágio de ultramicrótomo na câmara e um detector de elétrons retroespalhados de baixo quilovolt.
Crie imagens das amostras com essas configurações. Comece a análise selecionando o tipo de imagem e, em seguida, 8 bits para converter as imagens para o formato TIFF de 8 bits do proprietário original de 16 bits. Se a conversão automática de contraste e/ou brilho durante esta etapa não for ideal para imagens, reabra as imagens de 16 bits e pressione image. Ajuste o contraste do brilho.
Selecione um intervalo que funcione para todas as imagens e pressione Aplicar. Em seguida, execute a conversão. Se houver movimento de imagem inaceitável entre as fatias, alinhe as pilhas de imagens selecionando Plug-ins, Registro e alinhamento de pilha linear com SIFT e defina o alinhamento para o modo somente de conversão em vez de corpo rígido.
Aumente o tamanho da tela antes do registro, selecionando a imagem para ajustar o tamanho da tela. Como alternativa, reduza a imagem a uma área de interesse selecionando a região desejada e cortando-a. Se necessário, dimensione as imagens para um tamanho menor e mais gerenciável usando a imagem j e, em seguida, selecionando imagem e dimensionamento.