Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:33 min. • May 29th, 2025
Comece com um conjunto de perfusão colocado no palco de um microscópio invertido.
O conjunto de perfusão contém um nervo periférico dissecado preso entre uma lamínula e uma lâmina de microaqueduto com perfusão salina contínua.
Os axônios mielinizados do nervo expressam os neurofilamentos verdes marcados com fluoróforo.
Usando iluminação de campo claro, concentre-se nos axônios mielinizados.
Mude para o modo confocal, fotobranqueie com alta potência do laser e, em seguida, capture uma imagem de referência de baixa autofluorescência usando baixa potência do laser.
Desenhe linhas paralelas ao longo do axônio para definir o comprimento da janela de fotoativação. Use isso como um guia para criar uma região de ativação retangular.
Ilumine esta região com um comprimento de onda específico para ativar os neurofilamentos marcados com fluoróforo verde, fazendo com que eles fluoresçam. Adquira a imagem.
Após a ativação, capture imagens com lapso de tempo.
Com o tempo, os neurofilamentos fluorescentes se movem em ambas as direções e se espalham para regiões flanqueadoras adjacentes.
O aparecimento de fluorescência nas regiões flanqueadoras adjacentes à região de ativação confirma o transporte de neurofilamentos.
Segure a extremidade proximal do nervo e coloque-a lentamente sobre uma lamínula. Em seguida, endireite-o sob tensão suave. Coloque a corrediça do microaqueduto sobre o nervo com a corrediça ranhurada para baixo e posicione a direção do fluxo paralela ao nervo. Vire a lamínula e o conjunto do microaqueduto e coloque-o no compartimento da câmara de perfusão com a corrediça oposta à junta externa.
Para prender a câmara de perfusão, coloque-a no invólucro de metal e gire o anel de travamento. Pressione lentamente o êmbolo da seringa salina e encha a câmara de perfusão. Mantenha a tubulação de entrada e saída, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Transfira o conjunto de perfusão para um microscópio invertido stage e monte a seringa salina na bomba de seringa. Em seguida, ligue o motor e ajuste a velocidade para uma vazão de 0,25 mililitros por minuto.
Conecte o aquecedor de solução em linha e ajuste-o para 37 graus Celsius. Conecte o aquecedor objetivo e ajuste-o para 37 graus Celsius. Aplique óleo na objetiva e insira a câmara de perfusão no suporte do estágio. Aplique óleo na almofada do aquecedor da câmara e conecte-a à câmara de perfusão. Em seguida, conecte-o e ajuste-o para 37 graus Celsius.
Trave a câmara de perfusão no adaptador de platina e coloque o óleo da objetiva em contato com a lamínula na parte inferior da câmara. Use a iluminação de campo claro para focar na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próxima da superfície da lamínula. Os axônios mielinizados podem ser identificados pela presença de uma bainha de mielina, que é visível sob iluminação de luz transmitida por campo claro sem aumento de contraste.
Adquira uma imagem de referência de campo claro, registrando a direcionalidade do nervo. Em seguida, adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nanômetros e um filtro de emissão apropriado para GFP fotoativável. Defina a potência do laser para aproximadamente cinco vezes a potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de três a quatro minutos. Em seguida, adquira outra imagem confocal para registrar a autofluorescência de pré-ativação após a etapa de branqueamento.
Desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho desejado da janela de ativação da imagem de campo claro. Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse no campo de visão perpendicular aos axônios. Ative a fluorescência GFP nesta região por excitação de padrão com a luz de 405 nanômetros, certificando-se de que uma imagem seja adquirida imediatamente antes e imediatamente após a ativação. Quando a ativação terminar, inicie um cronômetro de um minuto. Quando disparar, inicie a aquisição de uma série de lapso de tempo.