Imagem de bioluminescência para estudar transientes de cálcio em estruturas cerebrais de Drosophila

Prenda uma Drosophila transgênica imobilizada com a cabeça exposta em uma câmara de gravação em um microscópio de fluorescência stage.

O corpo do cogumelo da mosca compreende neurônios que expressam proteína de fusão bioluminescente sensível ao cálcio, que é ativada por um cofator pré-carregado.

Conecte um tubo de perfusão à câmara. Localize os corpos dos cogumelos fluorescentes, concentrando-se no cálice e nos lobos mediais. Confirme a drenagem com tampão.

Defina os parâmetros de imagem e concentre-se no cálice e nos lobos mediais. No escuro, adquira imagens de fluorescência de linha de base dos corpos dos cogumelos antes da exposição ao estimulante.

Perfundir nicotina em tampão contendo cálcio para ativar os receptores nicotínicos de acetilcolina, desencadeando o influxo de cálcio e a emissão de luz bioluminescente.

Lavar com tampão para restaurar as condições basais.

Perfundir cloreto de potássio para despolarizar os neurônios, desencadeando a liberação intracelular de cálcio e emissão de sinais bioluminescentes.

Lavar com tampão para restaurar as condições basais.

Analisar imagens para avaliar a atividade espacial e temporal do cálcio no cálice e nos lobos mediais.

- Em seguida, coloque a amostra no suporte sob o microscópio e ajuste a ampliação para 5x. Em seguida, insira o tubo de perfusão no canal através da punção. Defina o microscópio para o modo fluorescente e, em seguida, centralize e coloque os corpos dos cogumelos em foco. Quando os corpos dos cogumelos estiverem em foco, altere a ampliação para 20x. Recentralize a imagem e ajuste o foco.

Em seguida, posicione o aparelho de drenagem sobre a piscina de drenagem e ajuste a altura do shunt de drenagem para que a ponta fique logo acima da piscina de drenagem. Em seguida, lave a amostra com a solução de Ringer por 30 segundos para verificar se há drenagem adequada. Por fim, puxe a blindagem para baixo para vedar o aparelho de qualquer luz externa.

Usando o sistema automatizado no programa Photon Imager, faça ajustes finos no foco e obtenha uma imagem fluorescente de referência dos corpos dos cogumelos. Ajuste a posição das caixas da região de interesse sobre o cálice, os corpos celulares e os lobos mediais clicando nas caixas e arrastando-as para a posição enquanto mantém pressionada a tecla Control.

Agora, registre os valores da linha de base por cerca de 5 a 10 minutos. Em seguida, ligue o interruptor para iniciar o fluxo de nicotina. Ao mesmo tempo, pressione Enter e adicione uma nota para indicar que o fluxo de nicotina começou. Após um minuto, pare o fluxo e faça outra anotação no log significando que o fluxo foi interrompido. Em seguida, lave a amostra com solução de Ringer por cinco minutos.

Enquanto a amostra se recupera, desligue a lavagem, ajuste o cronômetro para mais cinco minutos e prepare-se para iniciar o fluxo de cloreto de potássio. Quando estiver pronto para começar, inicie o fluxo de cloreto de potássio e insira 100 milimolares de cloreto de potássio no registro de amostra. Após um minuto, pare o fluxo e insira o cloreto de potássio desligado no registro de amostra. Em seguida, lave a amostra com a solução de Ringer por um minuto e mude o microscópio para o modo fluorescente. Pegue uma imagem fluorescente final e, em seguida, desligue a solução de Ringer e remova a amostra.