Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Comece com uma larva de peixe-zebra transgênica anestesiada imobilizada em agarose e colocada em uma placa de Petri contendo uma solução anestésica.

Posicione-o sob um microscópio a laser de dois fótons, que usa dois fótons para imagens detalhadas.

Concentre-se nas camadas superior e inferior do cérebro para definir os limites da imagem.

Capture imagens em várias profundidades para observar os neurônios antes do tratamento a laser.

Ajuste o foco na região de interesse e ajuste o tamanho do quadro para refinar o foco nos neurônios.

Selecione e irradie os neurônios usando o laser de dois fótons.

O laser induz calor localizado, resultando em morte neuronal com danos mínimos ao tecido circundante. Capture a imagem.

Compare imagens pré e pós-tratamento para avaliar as alterações de fluorescência.

Reoriente os neurônios em planos mais profundos e repita a irradiação para tratar todos os neurônios na região de interesse.

Recapture a imagem e compare-a com a imagem pré-tratamento. A perda de fluorescência após o tratamento com laser confirma o sucesso da ablação neuronal.

Coloque a larva embebida em agarose sob um microscópio de varredura a laser de 2 fótons e inicie o sistema de microscopia. Abra o software de aquisição de imagem e, na guia Laser, clique no botão liga para ligar o laser. Aguarde até que o status do laser mude de Ocupado para Modo bloqueado.

Na guia Canais, defina o comprimento de onda do laser para 880 nanômetros para ablação EGFP ou 800 nanômetros para ablação GcAMP. Selecione a lente objetiva de 20x movendo manualmente o revólver da lente. Em seguida, clique na guia Localizar. Clique em GFP para alterar os caminhos ópticos e visualizar diretamente a fluorescência a olho nu. Centralize o cérebro da larva do peixe-zebra no campo de visão. Em seguida, clique na guia Aquisição para voltar à microscopia de dois fótons e definir a potência e o ganho do laser.

Como um registro da condição antes da ablação, clique em Z-Stack para selecionar a opção Z-Stack. Em seguida, depois de focar na extremidade ventral do cérebro larval, clique no botão Definir primeiro para definir o limite inferior. E depois de focar na superfície mais dorsal do cérebro, clique no botão Definir último botão para definir o limite superior. Por fim, clique no botão Iniciar experimento para executar a aquisição de imagem Z-Stack.

Em seguida, selecione a lente objetiva 63x movendo manualmente o revólver da lente. Em seguida, clique na guia Localizar para alternar para a microscopia de epifluorescência. Centralize as células a serem ablacionadas pelo olho. Em seguida, clique na guia Aquisição para voltar à microscopia de varredura a laser.

Na guia Modo de aquisição, defina o tamanho do quadro como 256 por 256. Clique em Ao vivo e observe os neurônios de interesse. Em seguida, começando pelo lado mais dorsal, encontre um plano focal no qual as células a serem abladas estejam em foco. Usando a função Regiões, marque uma pequena área circular com cerca de um terço do tamanho da célula em diâmetro em cada neurônio como uma ROI.

Defina a velocidade de varredura para 13,93 segundos por 256 por 256 pixels, o que corresponde a um tempo de permanência do laser de aproximadamente 200 microssegundos por pixel ou 200 microssegundos por meio mícron. Além disso, defina o ciclo de iteração para 4 repetições. Clique em Iniciar experimento para executar as funções de série temporal e branqueamento. Compare a imagem antes da ablação com a imagem após a ablação no ciclo da série temporal, para garantir que a fluorescência nas células-alvo tenha desaparecido.

Em seguida, mova o plano focal um pouco mais fundo e escolha o próximo plano focal onde as células não abladas aparecem. Execute a função de branqueamento como acabamos de demonstrar e repita o processo até que todas as células da estrutura neural de interesse tenham sido abladas. Após a ablação, verifique se as células estão com fluorescência abolida e repita a irradiação do laser, se necessário.