Imagem de células vivas da migração nuclear glial de Muller durante a regeneração da retina do peixe-zebra

Comece com um explante retiniano dorsal embebido em agarose de um peixe-zebra transgênico, montado em um fluorodish com meio.

A retina exibe danos fotorreceptores induzidos pela luz e contém células gliais de Muller ou MGCs com núcleos que expressam GFP.

Coloque o prato em uma câmara de microscópio multifóton.

Usando iluminação de campo claro, concentre-se na retina.

Mude para o modo de fluorescência para localizar os MGCs.

Configure uma pilha z da camada de células ganglionares ou GCL para a camada nuclear externa ou ONL.

Comece a criar imagens ao vivo.

Os fotorreceptores danificados liberam TNF-α, ativando os MGCs.

Os núcleos MGC migram basalmente dentro da camada nuclear interna ou INL para replicar seu DNA.

Em seguida, os núcleos migram apicalmente para o ONL para sofrer mitose, produzindo progenitores neuronais.

Após a mitose, os núcleos e progenitores do MGC migram basalmente de volta para o INL.

Os progenitores proliferam, migram para o local da lesão e se diferenciam em fotorreceptores, permitindo a regeneração da retina.

Analise as imagens capturadas para visualizar a migração nuclear.

No software de aquisição de imagem, abra as janelas A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI e ND Acquisition. Para imagens multifotônicas, certifique-se de que a opção IR NDD seja escolhida na janela A1 Compact GUI. Em seguida, no campo de configuração, selecione IR-DM para o primeiro espelho dicróico e verifique se o filtro passa-banda está definido para 525 a 50 para adquirir fluorescência GFP.

Em seguida, ligue o laser IR na janela da GUI do A1 MP. Levará alguns minutos para que o laser esteja pronto. Depois disso, defina o comprimento de onda para 910 nanômetros para excitar a fluorescência GFP e alinhe o laser clicando no botão Alinhamento automático.

Depois de colocar a cultura de retina no microscópio multifotônico stage, certifique-se de que as luzes da sala e do equipamento estejam desligadas antes de abrir o obturador para evitar a superexposição do tubo fotomultiplicador. Para reduzir os níveis de ruído, coloque o microscópio em um ambiente escuro.

Adquira imagens de um campo de visão de 300 por 300 pixels com um zoom de 2, que são definidas na janela Área de varredura, e um tempo de permanência de pixel de 4,8 microssegundos por pixel escolhido na janela A1 Compact GUI. Configure aproximadamente a potência do laser alterando a área de aquisição na janela da GUI do A1 MP e o ganho na janela da GUI do A1 Compact.

Agora, concentre-se na camada de células ganglionares e defina o plano focal superior da pilha z na subjanela Z dentro da janela ND Acquisition. Mova o plano focal através do nível da camada nuclear externa, que é caracterizada pela presença de células GFAP e GFP-positivas vagamente marcadas que são redondas e aumentadas em relação às suas contrapartes na camada nuclear interna.

Defina este plano como a parte inferior da pilha z. Em seguida, defina o tamanho do passo z entre 0,7 e 1 micrômetro. Para configurar a correção de intensidade z, abra a janela Correção de intensidade Z e escolha De ND para definir o intervalo de pilha z. Em seguida, clique no plano focal inferior na janela Correção de intensidade Z e defina a intensidade e o ganho do laser.

Em seguida, clique na seta ao lado dos valores z na janela Correção de intensidade Z para confirmar as configurações que são mostradas posteriormente em Configurações do dispositivo na janela Correção de intensidade Z para o plano focal escolhido. Repita o processo para os planos médio e superior, aumentando a potência e o ganho do laser.

Defina a área de aquisição na janela da GUI A1 MP e evite selecionar uma área de aquisição maior que 15 e um ganho maior que 126 no início da imagem para contornar o fotobranqueamento e o aumento dos níveis de ruído. Em seguida, escolha a correção de intensidade relativa na janela Correção de intensidade Z. Na subjanela de série temporal da janela Aquisição de ND, defina a duração como oito horas e o intervalo como sem atraso. Em seguida, clique em Executar correção Z na subjanela Z-Stack da janela Aquisição ND para adquirir séries temporais 3D.