JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:06 min • June 17th, 2025
Comece com larvas de peixe-zebra transgênicas anestesiadas em uma câmara de montagem contendo um tampão fisiológico oxigenado sob um estereomicroscópio.
O cerebelo no cérebro contém neurônios de Purkinje geneticamente modificados que expressam proteínas citoplasmáticas fluorescentes.
Remova o excesso de meio e, em seguida, adicione agarose derretida para imobilizar as larvas para uma imagem estável.
Oriente o lado dorsal das larvas para cima para visualizar o cerebelo.
Depois de solidificado, apare o excesso de agarose. Usando uma agulha de vidro, excise a pele pigmentada que cobre o cérebro para expô-la.
Vire o bloco de agarose em uma câmara de imagem contendo agarose derretida para imagem sob um microscópio invertido.
Adicione o tampão fisiológico para preservar a função neuronal.
Posicione a câmara sob um microscópio confocal invertido. Aplique luz de excitação para excitar as proteínas fluorescentes, permitindo a visualização dos neurônios marcados.
As células pigmentadas da pele, se não forem removidas, espalham e absorvem a luz de excitação, reduzindo a intensidade da fluorescência.
A remoção da pele melhora a penetração da luz para aumentar a intensidade da fluorescência, facilitando a visualização dos neurônios.
Para incorporar a larva, use uma pipeta de Pasteur para transferir a larva anestesiada para uma câmara de montagem sob um estereomicroscópio. Se alguma larva ainda for capaz de se mover, não use o peixe para o experimento até que o peixe esteja completamente incapaz de se mover. Quando a larva estiver imóvel, remova cuidadosamente o excesso de meio e adicione imediatamente pelo menos 1 mililitro de agarose de baixo ponto de fusão na larva.
Oriente o peixe-zebra com a região dorsal voltada para cima o mais próximo possível da superfície da agarose. Se as larvas forem visualizadas usando um microscópio invertido, após a solidificação, corte a agarose contendo a larva em um pequeno bloco cubóide. Para expor o cérebro para imagens, apare o excesso de agarose sobre a região cerebral de interesse, conforme necessário, e use uma agulha de vidro para fazer uma pequena incisão na pele próxima, mas não sobre a região de interesse, sem penetrar muito profundamente no tecido.
Mal movendo a agulha logo abaixo da superfície da pele, continue a fazer cortes muito pequenos ao redor da região de interesse até que a pele sobre a região de interesse possa ser removida ou empurrada para o lado. Quando o tecido tiver sido removido de todos os embriões, adicione uma pequena gota de agarose de baixo ponto de fusão a uma câmara de imagem previamente preparada de um microscópio invertido e use uma pequena espátula para virar o bloco de agarose cubóide 180 graus na gota de agarose na câmara de imagem. Quando a agarose estiver solidificada, encha a câmara de imagem com ACSF fresco e comece a visualizar a larva.